酶聯(lián)免疫酶標(biāo)法在臨床中的應(yīng)用

董韶偉 曹桂琴 趙丹華

河南省平頂山市平煤醫(yī)療集團(tuán)一礦醫(yī)院,河南 平頂山 467000

1 前言

近幾年來(lái),免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快,特別是在使用標(biāo)記抗原和抗體的分析技術(shù)以后,使原來(lái)許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比,由于酶的高效生物催化作用,一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘可以催化幾百個(gè)低分子發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生了放大作用,使得原來(lái)及微乎其微的抗原、抗體在數(shù)分鐘就可以識(shí)別出來(lái),這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法 (ELLSA法)。

ELLSA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病,寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷,也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定。根據(jù)三年來(lái)的使用結(jié)果分析,認(rèn)為ELLSA酶標(biāo)法具有靈敏特異,簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn),不僅適用臨床標(biāo)本的檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百,甚至上千萬(wàn)標(biāo)本。因此,也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查,本法逼近可以用來(lái)檢測(cè)抗體,而且也可應(yīng)用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原,所以也是一種早診斷的方法。我院從 2006年元月至 2009年元月,用 ELLSA酶標(biāo)法檢測(cè)傳染病總?cè)藬?shù)為 7890人,乙型肝炎患者為 758人,甲肝患者為 10人,丙肝患者為 35人,梅毒患者 19人。用ELLSA酶標(biāo)法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。

2 測(cè)定抗體的種類方法原理

測(cè)定抗原體有四種方法：競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗體 (抗原)夾心法、雙位一步法、捕獲法。競(jìng)爭(zhēng)法原理：將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體,洗滌待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液;使之與固相抗體中含有抗原,則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性地占去酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少,加底物顯色,參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多,故顏色最深。參管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差,代表受檢標(biāo)本抗原的量,待測(cè)管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。

雙抗體夾心法原理：將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌出去結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。加受檢標(biāo)本,使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗原結(jié)合,形成固相抗原結(jié)合物,洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。加酶標(biāo)抗體,使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗原結(jié)合,徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí),固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

雙位點(diǎn)一步法原理：在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí),如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇單克隆,抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并成一步。

捕獲法原理：將抗人 Igm抗體連接在固相載體上,形成固相抗人 Igm,洗滌、加入稀釋的血清標(biāo)本,保溫反應(yīng)后,血清中的Igm抗體被固相抗體捕獲,洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分,加入特異性抗原試劑,這只與固相上的特異性 Igm結(jié)合,洗滌加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體,使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合,加底物顯色。如有顏色顯示,則表示血清標(biāo)本中的特異性 Igm抗體存在,是陽(yáng)性反應(yīng)。

3 判斷方法

“+”或 “—”所有超過(guò)規(guī)定的 OD值的標(biāo)本均屬陽(yáng)性,此規(guī)定OD值是根據(jù)事先測(cè)定的大量陰性標(biāo)本所取得的,此規(guī)定是陰性標(biāo)本的上限,或者以一組陰性標(biāo)本 OD平均值加 2—3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作為陽(yáng)性閾值。

直接以 OD值來(lái)表示如 0.4、0.7、1.2,OD值越大,陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)但此數(shù)值實(shí)在固定實(shí)驗(yàn)室條件下,得到的結(jié)果,而且每次實(shí)驗(yàn)都要有參考標(biāo)本作對(duì)照。

以終點(diǎn)滴度表示,將標(biāo)本作連續(xù)稀釋,最高稀釋度能出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)者 (即OD值仍大于陽(yáng)性閾值,即為該標(biāo)本的滴度)。以 “比值”表示,求出被檢標(biāo)本的 OD值的比值。例如：為陰性標(biāo)本的 2倍或 3倍,即為陽(yáng)性比值小于2.1或大于 1.5為疑,〈1.5為陰性。測(cè)定標(biāo)本OD值 -空白OD值∕陰性對(duì)照 OD值 -空白 OD值 ＞2.1

4 ELLSA酶標(biāo)法在臨床的應(yīng)用

ELLSA酶標(biāo)法應(yīng)用范圍很廣,而且正在不斷擴(kuò)大,原則上ELLSA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原,可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。在實(shí)際應(yīng)用方面可作疾病的臨床診斷,疾病監(jiān)測(cè),疾病普查等,因此,它和生物學(xué)免疫學(xué)、微生物學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面,密切相關(guān)。檢查抗原和半抗原方面,在內(nèi)分泌方面,已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素,絨毛膜促性腺素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇,促甲狀腺和孕酮等。某敏感性與RIA相等。在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白 (AFP)癌胚抗原 (CEA)對(duì)前面的敏感性已達(dá)到與放射免疫水平相等等。

在傳染病的診斷方面正在日益擴(kuò)大,其中最滿意的是用于檢查乙型肝炎、甲肝、丙肝、梅毒、艾滋等。

[1]王穎,呂卓人,袁育康,張漢偉,等.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清內(nèi)源性哇巴因 [J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1998,35：763-764.