Smad4在腫瘤中的研究進(jìn)展

閆繼東

(河北省唐山市工人醫(yī)院胸外科 河北唐山 063000)

1 Smad4的發(fā)現(xiàn)和鑒定

人類第18號(hào)染色體長臂區(qū)域上的等位基因雜合性缺失是多種腫瘤的頻發(fā)事件，迄今在這一區(qū)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了多個(gè)腫瘤抑制基因，如DCC、MADR2/JV18-1、DPC4(Smad4)等。其中Smad4蛋白是TGF-β信號(hào)傳遞途徑的必需物質(zhì)，處于中樞地位。1995年，有學(xué)者在研究黑腹果蠅Dpp體內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)DppI型受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的下游分子，并克隆其基因，這個(gè)基因被命名為Mad，隨后有學(xué)者克隆出Mad相關(guān)基因sma2、sma3、sma4，并認(rèn)為其為mad同源物，在體內(nèi)可以形成復(fù)合物并協(xié)同發(fā)揮作用。后來人們將各種mad相關(guān)蛋白統(tǒng)一命名為Smad，因此這類蛋白統(tǒng)稱為Smads蛋白。當(dāng)前包括Smad1-9，它們都存在于細(xì)胞質(zhì)中，作用是將TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入核內(nèi)并參與TGF-β靶基因的調(diào)節(jié)。

Smad4作為Smads蛋白家族的重要成員，其基因定位于染色體18q21.1，含有11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子，其核苷酸序列保存在GenBank的U44378中，基因的轉(zhuǎn)錄子長2680bp，是編碼552個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。Smad4蛋白是通過研究多重終止密碼子和啟動(dòng)子拼接位點(diǎn)而確定的。Smad4的一級(jí)結(jié)構(gòu)分為3個(gè)區(qū):N端區(qū)、C端區(qū)和中間連接區(qū)。N端區(qū)和C端區(qū)與其他動(dòng)物的MAD蛋白高度同源，因此也稱MH1和MH2，中間連接區(qū)富含脯氨酸。Smad4與其它的Smad不同，其MH2沒有磷酸化結(jié)構(gòu)SSXS，單獨(dú)存在不足以行使信號(hào)傳導(dǎo)功能，必須有部分中間連接區(qū)才能傳遞信號(hào)，這部分稱為Smad4的活性區(qū)。Smad4被認(rèn)為是通用調(diào)節(jié)分子，因?yàn)樗鼛缀跄芘c所有活化的受體調(diào)節(jié)型Smads蛋白結(jié)合，并形成低聚體復(fù)合物，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2 Smad4蛋白的功能及作用機(jī)理

Smad4蛋白與TGF-β密切相關(guān)，是TGF-β受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要成員。TGF-β是一種多功能多肽，在組織的發(fā)育、再生及修復(fù)中起重要作用;TGF-β還是一種具有多功能活性的細(xì)胞因子，其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡，對(duì)多種細(xì)胞因子有重要影響。TGF-β有兩型受體，每一型均含有細(xì)胞內(nèi)有絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)。TGF-β細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通過TGF-β I型、II型受體完成，這兩種受體都有一跨膜片斷，外端暴露于細(xì)胞外，內(nèi)端插在胞漿中。它們也是絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過活化受體的磷酸化，從而使受體調(diào)節(jié)型Smad也活化?；罨氖荏w調(diào)節(jié)型Smad協(xié)同Smad將受體信號(hào)傳到核內(nèi)。許多Smad基因都介導(dǎo)了TGF-β超家族的功能，包括骨形成蛋白、活化素和TGF-β。Smad4在腫瘤中發(fā)病中，常常突變，突變類型以點(diǎn)突變?yōu)橹?，還可以有錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變等，突變后的Smad4蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，不能與磷酸化的Smad2和Smad3結(jié)合，從而不能發(fā)揮調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用。Smad4的MH1域突變并不影響其本身的活性，但突變型的Smad4比野生型的更容易被激活泛素連接酶降解。磷酸化的TGF-β被激活后，可活化Smads蛋白，主要是Smad4，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，控制腫瘤細(xì)胞生長、分化及凋亡。此通路受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，其任何一個(gè)元件失調(diào)，均可引起細(xì)胞增生，而在腫瘤細(xì)胞形成過程中可引起分化異常，進(jìn)而引起異常腫瘤性增生。體內(nèi)細(xì)胞分泌的TGF-β主要通過調(diào)控核內(nèi)CKI(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子)的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期運(yùn)行，抑制細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。在信號(hào)傳導(dǎo)過程中，活化的TGF-β1與其膜返體結(jié)合后形成兩種異二聚體復(fù)合物，繼而磷酸化下游的Smad2，Smad3蛋白，磷酸化后的Smad2和Smad3可與Smad4形成異源復(fù)合物，由胞漿移位至胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。有觀點(diǎn)認(rèn)為Smads家族的基它成員也參與到此通路中，并形成正反饋與負(fù)反饋的平衡，共同調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展。但是有觀點(diǎn)認(rèn)為TGF-β在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中是一把“雙刃劍”，即在癌變期之初作為抑癌因子出現(xiàn)，而在癌癥晚期則通過自分泌(作用于癌細(xì)胞本身)和旁分泌(作用于癌細(xì)胞周圍的微環(huán)境)方式刺激腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移，因此，Smads與TGF-β的通路作用可能更為復(fù)雜。

3 Smad4在腫瘤中的作用

Smad4研究最多是在胰腺組織中，Smad4在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，同時(shí)相關(guān)研究表明胰腺癌中Smad4/TGF-β通路與PTEN和NF-kappaB調(diào)節(jié)有關(guān)。還有觀點(diǎn)認(rèn)為胰腺癌中SCF(beta-TrCP1)對(duì)Smad4蛋白有重要的調(diào)節(jié)作用。范振斌等通過對(duì)30例移行細(xì)胞癌新鮮癌組織進(jìn)行分析和精細(xì)遺傳作圖，并用DPC4/Smad4抗體對(duì)相應(yīng)的病理組織切進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示DPC4/Smad4三個(gè)緊密聯(lián)鎖的微衛(wèi)星位點(diǎn)D18S46、D18S363、D18S474有高頻率的雜合性缺失，18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有5個(gè)點(diǎn)在所分析人群中多態(tài)性甚低，與西方人數(shù)據(jù)差別明顯;且免疫組化顯示DPC4/Smad4在80%的腫瘤中表達(dá)下降或不表達(dá)，與微衛(wèi)星雜合性缺失對(duì)應(yīng)良好，并認(rèn)為抑癌基因DPC4/Smad4的失活在中國人膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用，其等位基因的雜合性缺失是該基因失活的重要機(jī)制。有觀點(diǎn)認(rèn)為當(dāng)RSmad被I型受體磷酸化，從而導(dǎo)致與CO-Smad Smad4結(jié)合，復(fù)合體進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，一旦進(jìn)入細(xì)胞核，Smad復(fù)合體與其他轉(zhuǎn)錄共刺激信號(hào)組成共抑制分子，共同控制靶基因的表達(dá)，因此伴隨著Wnt信號(hào)系統(tǒng)異常調(diào)節(jié)，或者由于Wnt基因的異常表達(dá)，破壞了正常的Wnt/B-catenin、Notch、BMP的信號(hào)系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞可自分泌大量的TGF-β1，磷酸化R-Smad，從而導(dǎo)致與CO-Smad Smad4結(jié)合，Smad4的減少，使細(xì)胞對(duì)TGF-β1的生長抑制產(chǎn)生耐受，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。伴隨著Notch信號(hào)途徑的異常表達(dá)，引起下游級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)TGF-β超家族在內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的異常，Smad4作為TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成元件，對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有著關(guān)鍵作用。其缺失或突變可使細(xì)胞對(duì)TGF-β1的生長抑制產(chǎn)生耐受，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。體外細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了此觀點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示Smad4與CyclinD1在膀胱癌中具有正相關(guān)性，且隨著腫瘤惡性程度的增高，二者的表達(dá)率均下降，認(rèn)為Smad4與CyclinD1的表達(dá)與自然病程密切相關(guān)，其表達(dá)變化是腫瘤進(jìn)展的表現(xiàn)。張磊等通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)多Smad4、CyclinD1、Survivin和Cox-2在44例大腸癌組織中的表達(dá)，認(rèn)為其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)了解大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后有重要意義，Smad4可作為一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)判斷大腸癌的預(yù)后。SELIL與Smad4蛋白在食管癌中具有協(xié)同作用，SELIL在食管癌中的作用可能通過TGF-β信號(hào)途徑影響基因的表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞的生長。吳鵬等通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Smad4基因表達(dá)，觀察其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，認(rèn)為其能篩選出特異而高效阻斷Smad4基因表達(dá)功能的shRNA，Smad4基因表達(dá)下調(diào)能明顯促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長。Blackford等認(rèn)為Smad4基因突變與胰腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。Kloth等通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)117例原發(fā)性宮頸癌患者的Smad4進(jìn)行檢測(cè)，顯示腫瘤中Smad4低表達(dá)，并認(rèn)為細(xì)胞漿中Smad4的弱表達(dá)和細(xì)胞核中表達(dá)的缺失與宮頸癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，Smad4在不同腫瘤中的表達(dá)均有變化，提示Smad4參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

4 Smad4在肺癌中的作用

有學(xué)者在1998年對(duì)肺癌組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中相關(guān)的Smad4/TGF-β基因進(jìn)行分析，認(rèn)為Smad4/TGF-β參與了腫瘤的發(fā)生。Gemma等通過Northern blot、RT-PCR等技術(shù)對(duì)肺癌細(xì)胞系TGF-β的表達(dá)進(jìn)行分析，認(rèn)為TGF-β可以調(diào)節(jié)MMP-2、PAI-1、IL-1及CEA等多種細(xì)胞因子，在肺癌的發(fā)生中具有至關(guān)重要的作用。Ke等認(rèn)為Smad4通過不同的機(jī)制影響腫瘤的血管生成，并通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肺癌中DPC4/Smad4與血管生成的關(guān)系，結(jié)果顯示DPC4/Smad4能降低腫瘤組織中VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)，增加TSP1蛋白和mRNA的表達(dá)，確認(rèn)DPC4/Smad4是一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)，并在腫瘤轉(zhuǎn)移及血管生成中發(fā)揮重要作用。Filyak等認(rèn)為Smad2、Smad3、Smad4蛋白下調(diào)，而Smad7上調(diào)對(duì)人肺癌A549細(xì)胞系的發(fā)生發(fā)展有重要作用。Finger等認(rèn)為TGF-βRIII作為一個(gè)新的腫瘤抑制基因在肺癌細(xì)胞系中普遍丟失，其表達(dá)可能與腫瘤的浸潤等生物學(xué)行為有關(guān)。因此，關(guān)于Smad4/TGF-β在肺癌及肺組織中表達(dá)，主要研究在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中，而對(duì)肺癌組織中蛋白的表達(dá)及mRNA的表達(dá)關(guān)注較少。

5 臨床意義和展望

目前關(guān)于Smad4在腫瘤中的研究是人們關(guān)注的熱點(diǎn)，其可以作為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)，因此，臨床可以借助相關(guān)的輔助方法來判斷患者預(yù)后。但是由于TGF-β超家族成員龐大，受體配體間組合作用多樣化，個(gè)體成員在不同腫瘤中發(fā)揮作用也不盡相同，因此對(duì)于其真正的作用機(jī)制及干擾因素，臨床及基礎(chǔ)研究中并不十分清楚，對(duì)其機(jī)理及影響因素的研究將是當(dāng)前研究的重要方向。同時(shí)構(gòu)建合格的人類腫瘤動(dòng)物模型，進(jìn)行阻斷Smad4/TGF-β通路的研究，有望成為腫瘤研究及治療的靶點(diǎn)，可以為腫瘤的治療提供新的思路。由于Smad4/TGF-β為腫瘤研究的新領(lǐng)域，與其它研究一樣，還有哪些基因可以誘導(dǎo)其強(qiáng)表達(dá)或弱表達(dá)？動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)Smad4/TGF-β的干擾能否直接用于臨床？Smads家族的其它成員，如Smad1、Smad2、Smad3、Smad7與Smad4/TGF-β是否具有相互作用？等等。相信隨著這些問題廣泛而深入的研究，對(duì)于抗腫瘤通路的研究及治療將開辟新的途徑。

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