利用代謝工程技術(shù)提高工業(yè)微生物對(duì)脅迫的抗性

付瑞燕，李寅

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，合肥 230061

2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

利用代謝工程技術(shù)提高工業(yè)微生物對(duì)脅迫的抗性

付瑞燕1，李寅2

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，合肥 230061

2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

代謝工程是工業(yè)微生物菌種改造的平臺(tái)技術(shù)，不僅可用于改變微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝流向，也可以用于改善工業(yè)微生物的生理功能。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，微生物細(xì)胞會(huì)面臨多種脅迫作用，這些脅迫誘導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)作用，都有可能影響細(xì)胞的許多重要生理功能，從而影響生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的效率。從工業(yè)應(yīng)用的觀點(diǎn)出發(fā)，選擇生產(chǎn)性能良好、對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的主要脅迫因素有較強(qiáng)耐受性的菌株至關(guān)重要。以下評(píng)述了借鑒傳統(tǒng)代謝工程技術(shù)和反向代謝工程技術(shù)來(lái)提高工業(yè)微生物對(duì)脅迫抗性的若干研究策略，提出了該領(lǐng)域目前存在的問(wèn)題，以及利用代謝工程技術(shù)改善微生物脅迫抗性——即微生物生理功能工程的發(fā)展方向。

代謝工程，工業(yè)微生物，脅迫抗性，生理功能工程

隨著近年來(lái)代謝工程的迅猛發(fā)展，定向改變和優(yōu)化微生物的生理功能即微生物生理功能工程也逐漸成為代謝工程的應(yīng)用領(lǐng)域之一[1]，以下就近年來(lái)借鑒代謝工程技術(shù)的思想，提高工業(yè)微生物脅迫抗性相關(guān)領(lǐng)域的最新方法和策略的進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述。

1 借鑒傳統(tǒng)代謝工程技術(shù)構(gòu)建脅迫抗性突變株

代謝工程發(fā)展早期，人們注重的是對(duì)生化和遺傳背景清楚的菌株，利用DNA重組技術(shù)對(duì)特定的代謝途徑進(jìn)行目的性修飾、設(shè)計(jì)與構(gòu)建，在相當(dāng)程度上更側(cè)重于分子生物學(xué)技術(shù)的表現(xiàn)形式。在具體的實(shí)踐中，常采用的方法有：構(gòu)建新的代謝途徑、拓展已有的代謝途徑和削弱已有的代謝途徑。構(gòu)建新的代謝途徑是指引入外源抗性基因來(lái)改造和修飾代謝網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞從不能合成某種代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚝铣纱舜x產(chǎn)物。拓展已有的代謝途徑是指通過(guò)基因工程手段引入外源基因，使原有代謝途徑進(jìn)一步向前或向后延伸，從而與相關(guān)的代謝途徑相連，組成完整有效的抗脅迫途徑。削弱已有的代謝途徑是指通過(guò)抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)或敲除內(nèi)源性基因，降低細(xì)胞中已有代謝途徑的流量。已有的研究表明，借鑒上述這 3種傳統(tǒng)代謝工程手段都可以提高微生物對(duì)脅迫的抗性。

1.1 構(gòu)建新的代謝途徑合成脅迫抗性物質(zhì)

乳酸乳球菌是乳球菌屬最重要和最典型的一個(gè)種。一直以來(lái)，乳酸乳球菌被人們用來(lái)作為乳制品發(fā)酵劑，如今又被發(fā)展成為生產(chǎn)食品級(jí)代謝產(chǎn)物的超級(jí)“細(xì)胞工廠”[5]，是原核細(xì)菌中一種重要的工業(yè)微生物。乳酸乳球菌的生長(zhǎng)依靠發(fā)酵產(chǎn)能，不需要氧的參與。并且，乳酸乳球菌缺乏高效的抗氧脅迫系統(tǒng)，其好氧生長(zhǎng)一般是弱于其靜置或厭氧生長(zhǎng)的。有氧呼吸代謝產(chǎn)生的能量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出發(fā)酵產(chǎn)能，因此，當(dāng)乳酸乳球菌作為宿主來(lái)生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物時(shí)，較低生物量和較長(zhǎng)發(fā)酵周期必然會(huì)影響生產(chǎn)強(qiáng)度。提高對(duì)氧的耐受性是工業(yè)生產(chǎn)對(duì)乳酸乳球菌提出的一個(gè)要求。

乳酸乳球菌的抗氧脅迫系統(tǒng)中沒(méi)有過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)，但存在超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD)。SOD在清除超氧陰離子自由基時(shí)會(huì)產(chǎn)生 H2O2，且 H2O2往往會(huì)積累在乳酸乳球菌的發(fā)酵液中。H2O2不僅是酵解過(guò)程中多種酶的抑制劑，還會(huì)引發(fā)毒性更大的羥自由基的產(chǎn)生。所以，H2O2被認(rèn)為是包括乳酸乳球菌在內(nèi)的許多乳酸菌好氧代謝所產(chǎn)生的最重要的抑制性物質(zhì)之一。絕大多數(shù)需氧微生物都含有CAT，CAT具有很高的轉(zhuǎn)換數(shù)，一個(gè)CAT分子可以每秒鐘將數(shù)百萬(wàn)個(gè)H2O2分子轉(zhuǎn)化為水和氧氣，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是細(xì)胞內(nèi)H2O2代謝的關(guān)鍵酶。因此，將編碼CAT的外源基因?qū)肴樗崛榍蚓蔀闃?gòu)建抗氧脅迫突變株的首選策略。Rochat等[6]從枯草芽胞桿菌中克隆編碼依賴血紅素的過(guò)氧化氫酶基因KatE，將其插入到乳酸乳球菌 NZ9000的 nisin啟動(dòng)子和信號(hào)肽SPUsp45下，結(jié)果有活性的 KatE分泌到了發(fā)酵液中。在4 mmol/L H2O2處理乳酸乳球菌1 h的氧脅迫條件下，重組菌的存活率比對(duì)照 (不含 KatE基因)提高800倍，表明KatE賦予乳酸乳球菌更強(qiáng)的H2O2抗性。并且，重組菌在振蕩條件 (240 r/min) 下培養(yǎng)3 d的存活率是對(duì)照的160倍。這表明，通過(guò)構(gòu)建新的代謝途徑合成 CAT可以有效地提高宿主菌乳酸乳球菌抵抗氧脅迫的能力。

1.2 拓展已有的代謝途徑組成完整有效的抗脅迫途徑

由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽還原酶 (Glutathione reductase，GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (Glutathione peroxidase，GPx) 和NADPH組成的依賴于谷胱甘肽 (Glutathione，GSH)的GPx系統(tǒng)對(duì)于釀酒酵母細(xì)胞具有不可替代的抗氧化作用。乳酸乳球菌中存在 GR和依賴于 GSH的GPx。雖然乳酸乳球菌不能合成 GSH，但可以從培養(yǎng)基中吸收GSH，并且被乳酸乳球菌吸收到胞內(nèi)的 GSH能夠提高細(xì)胞抵抗氧脅迫的能力。以上研究表明乳酸乳球菌中可能存在著一個(gè)不完整的抗氧脅迫途徑，因此，將GSH的合成代謝途徑導(dǎo)入乳酸乳球菌，有可能可以拓展已有的 GSH相關(guān)代謝途徑，從而構(gòu)建出一條完整的依賴于GSH的抗氧脅迫防線。

作者以能夠生物合成 GSH的乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ3203) 為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)GSH在乳酸乳球菌工程菌株抗氧脅迫的能力進(jìn)行了研究[7]，結(jié)果表明GSH可以提高宿主菌NZ9000對(duì)較高H2O2脅迫劑量 (50 mmol/L H2O2，15 min) 和甲萘醌 (超氧陰離子自由基生成劑) 所引發(fā)氧脅迫的抗性。由此表明，通過(guò)代謝工程手段在乳酸乳球菌 NZ9000中引入GSH合成能力，可以顯著提高宿主菌對(duì)氧脅迫的抗性。

1.3 削弱已有的代謝途徑

釀酒酵母具有其他微生物所不具備的高乙醇耐受性，因此自古以來(lái)被廣泛地應(yīng)用在乙醇生產(chǎn)中。但當(dāng)釀酒酵母自身產(chǎn)生的乙醇達(dá)到一定濃度時(shí)，對(duì)它本身也會(huì)產(chǎn)生毒性。隨著乙醇濃度的增加，釀酒酵母的增殖速度及存活率下降，進(jìn)一步提高乙醇的濃度，釀酒酵母的發(fā)酵會(huì)停止。因而關(guān)于釀酒酵母的乙醇耐受性的研究始終是酵母研究者關(guān)注的重要課題之一。

海藻糖 (Trehalose) 能提供微生物細(xì)胞碳源和能量，穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞抵御脅迫。Jung等[8]根據(jù)釀酒酵母 ATH1 (編碼酸性海藻糖酶)基因序列，PCR擴(kuò)增ATH1基因中+1~+500堿基序列的反義基因片段，分別與ADH1、CYC1和ATH1啟動(dòng)子融合，插入到質(zhì)粒中，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母。結(jié)果表明，含有ATH1反義基因的3株釀酒酵母重組菌中的酸性海藻糖酶表達(dá)水平均有所降低，其中重組質(zhì)粒中啟動(dòng)子為ADH1的釀酒酵母重組菌的下降幅度最大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌相比，釀酒酵母重組菌的乙醇產(chǎn)量更高，乙醇生成速率也更快。釀酒酵母重組菌在含有30%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高所需的發(fā)酵時(shí)間從88 h縮短至44 h。在乙醇濃度為8%的脅迫條件下，與對(duì)照相比，重組菌生長(zhǎng)速率快；并且，生長(zhǎng)8 h后，重組菌的存活率是對(duì)照的1.5倍。以上研究表明抑制海藻糖酶的表達(dá)水平可以提高釀酒酵母對(duì)乙醇的抗性。

與乳酸乳球菌抗氧脅迫突變株相比，釀酒酵母乙醇脅迫突變株的構(gòu)建效果并不理想，抗性提高幅度并不高。原因可能是目前對(duì)于釀酒酵母乙醇耐受機(jī)制還未深入了解，并且該脅迫是多基因參與的復(fù)雜脅迫過(guò)程[9]，因此瞄準(zhǔn)個(gè)別基因的做法收效甚微。對(duì)于這類機(jī)制較復(fù)雜的脅迫過(guò)程，必須尋找到所有必要的脅迫相關(guān)基因，才有可能獲得優(yōu)良的脅迫抗性突變株。

2 借鑒反向代謝工程技術(shù)構(gòu)建脅迫抗性突變株

傳統(tǒng)代謝工程雖然在氨基酸、核苷酸等高產(chǎn)菌的選育中取得成功，但對(duì)單個(gè)代謝途徑進(jìn)行改造，由于微生物代謝網(wǎng)絡(luò)的全局調(diào)控，往往并不能獲得預(yù)期的效果?；蚪M學(xué)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，提供了從全局規(guī)模上深刻認(rèn)識(shí)微生物生理和代謝特性的工具，從而推動(dòng)了一種新的代謝工程設(shè)計(jì)策略——反向代謝工程。如前所述，生理功能工程特別是脅迫生理功能的改造也遇到了類似的困難，因此，反向生理功能工程策略也應(yīng)運(yùn)而生[1]。反向生理功能工程可以在對(duì)脅迫機(jī)理沒(méi)有充分了解的基礎(chǔ)上，直接找出所希望表型的關(guān)鍵基因，為構(gòu)建特定微生物的脅迫突變株提供靶基因。目前，反向生理功能工程的研究主要借鑒反向代謝工程的手段來(lái)進(jìn)行，其基本研究步驟主要由以下3個(gè)方面組成：

2.1 在異源微生物或相關(guān)模型系統(tǒng)中獲得預(yù)期的表型

應(yīng)用反向生理功能工程，第一步是獲得預(yù)期的表型。目前可以采用的方法有結(jié)合高通量篩選方法的傳統(tǒng)誘變技術(shù)、全轉(zhuǎn)錄工程 (Global transcription machinery engineering，gTME) 和基因組重排 (Genome shuffling) 等。

傳統(tǒng)的誘變技術(shù)是一個(gè)行之有效的優(yōu)良菌株的選育技術(shù)，借助高通量的檢測(cè)手段，可以快速有效地從由化學(xué)誘變劑誘變過(guò)的突變?nèi)后w中篩選出預(yù)期表型，如Klein-Marcuschamer等[10]用小劑量NTG (致死率40%~50%) 誘變植物乳桿菌野生菌株，先后以pH為4.6±0.05 (用質(zhì)量濃度為5.5 g/L的L-乳酸調(diào)節(jié))或pH為3.85±0.05 (用HCl調(diào)節(jié)) 為篩選條件獲得耐受乳酸和低pH值的突變?nèi)后w，繼代培養(yǎng)2次，隨后涂布平板以分離單菌落。將分離出的菌株以相同的起始OD值接種在96孔板中，在蘋果酸終濃度為100 mmol/L (pH為4.0±0.1) 的脅迫條件下培養(yǎng)，以低于10%的選出率高通量免搖瓶篩選出了穩(wěn)定期OD值 (30~40 h) 高于野生菌株的酸脅迫抗性突變株。然而同樣條件下用gTME法獲得的酸脅迫抗性突變株選出率高于25%。為探究此結(jié)果背后的原因，進(jìn)一步作了深入研究。將用2種方法所獲得的突變株庫(kù)液體培養(yǎng)后高倍稀釋涂布在96孔板上，以獲得單菌落。在固體培養(yǎng)基中添加終濃度為900 mmol/L的NaCl、60 mmol/L的HCl和4 g/L的L-乳酸作為脅迫因子，培養(yǎng)后平板放置在 4℃下過(guò)夜以使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，再用高性能圖像分析系統(tǒng) AlphaImager 3400 System定量分析菌落生長(zhǎng)速率。結(jié)果表明，用NTG誘變獲得的突變株庫(kù)表型分離度顯著低于用gTME獲得的突變株庫(kù)，從而脅迫抗性突變株的篩出機(jī)率也隨之降低。

基因的結(jié)構(gòu)活化、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA降解、翻譯及翻譯后加工及蛋白質(zhì)降解等均為基因表達(dá)調(diào)控的控制點(diǎn)。其中在轉(zhuǎn)錄起始水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì)有效的重要方式。gTME就是這樣一個(gè)基于轉(zhuǎn)錄起始水平上的調(diào)控方法，它通過(guò)使整個(gè)基因組的轉(zhuǎn)錄發(fā)生全局性改變，從而導(dǎo)致許多由多種基因控制的復(fù)雜的細(xì)胞表型得到改變，最終獲得需要的優(yōu)良表型[11]。利用該方法獲得預(yù)期脅迫抗性突變株的基本程序?yàn)椋菏紫韧ㄟ^(guò)突變幾個(gè)影響全局轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白來(lái)造成多基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，篩選出脅迫抗性突變株，然后通過(guò)比較出發(fā)菌株和突變菌株的轉(zhuǎn)錄譜，得到與某一脅迫抗性表型相關(guān)的基因。原核生物和真核生物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制不同，因而可以在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)細(xì)胞表型調(diào)控產(chǎn)生全局性擾動(dòng)的關(guān)鍵蛋白也各不相同。

原核生物僅含有一種RNA聚合酶，可以直接起始轉(zhuǎn)錄合成RNA，通常由5個(gè)亞基組成，即σ、β、β'和2個(gè)α亞基，研究表明RNA聚合酶σ亞基和α亞基的突變可以提高大腸桿菌對(duì)脅迫的耐受性。例如，Alper等[12]通過(guò)對(duì)將大腸桿菌中編碼σ70因子的rpoD基因及其上游啟動(dòng)子之間的序列進(jìn)行幾輪易錯(cuò) PCR擴(kuò)增，使大腸桿菌整個(gè)基因組的轉(zhuǎn)錄發(fā)生全局性改變，最終獲得了在高濃度乙醇環(huán)境下耐受能力大幅度提高的脅迫抗性突變株。Klein-Marcuschamer等[13]構(gòu)建了大腸桿菌 RNA 聚合酶α亞基編碼基因(rpoA) 的突變株庫(kù)，結(jié)果表明，RNA聚合酶α亞基的突變有助于提高大腸桿菌對(duì)丁醇的耐受性。

真核生物有3種RNA聚合酶，分別催化不同類型RNA的合成，均不能獨(dú)立轉(zhuǎn)錄RNA，都必須在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助下才能進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子分為通用轉(zhuǎn)錄因子與序列特異的轉(zhuǎn)錄因子兩大類。前者因參與了幾乎所有基因的轉(zhuǎn)錄而得名，是RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組因子，為所有mRNA轉(zhuǎn)錄起動(dòng)共有，包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE 以及 TFIIF 等成員。后者則為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所必需，決定該基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)。Alper等[11]利用基于通用轉(zhuǎn)錄因子的gTME方法，運(yùn)用易錯(cuò) PCR改變釀酒酵母中 RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子TFIID中TATA盒結(jié)合蛋白SPT15和TATA盒結(jié)合蛋白相關(guān)因子TAF25的編碼基因，構(gòu)建2個(gè)gTME突變文庫(kù)后轉(zhuǎn)化入釀酒酵母中。通過(guò)在培養(yǎng)基中逐步提高乙醇和葡萄糖的濃度，篩選出了乙醇和葡萄糖耐受性提高的突變株spt15-300。與對(duì)照相比，突變株spt15-300 的生長(zhǎng)性能顯著提高，對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，生物量更高，乙醇產(chǎn)率也更高。可見(jiàn)，作為一種基于已有的基因知識(shí)來(lái)設(shè)計(jì)的代謝工程技術(shù)，gTME可以更理性地對(duì)工業(yè)微生物的表型進(jìn)行優(yōu)化。

利用基因組重組進(jìn)行脅迫抗性突變株定向篩選的基本方法為：首先用傳統(tǒng)的誘變方法獲得一個(gè)突變株庫(kù)，篩選出若干脅迫抗性提高的突變株作為出發(fā)株，然后以多輪遞歸原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機(jī)重組，最終從獲得的突變株庫(kù)中篩選出抗性顯著升高的突變株。克魯斯假絲酵母是一種極具潛力的燃料乙醇生產(chǎn)菌種。但是發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，加劇乙醇對(duì)細(xì)胞的抑制作用。并且，乙酸普遍存在于木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中，因此，提高酵母對(duì)乙酸的耐受性是需要解決的一個(gè)重要問(wèn)題。Wei等[14]利用紫外線誘變克魯斯假絲酵母 GL560的原生質(zhì)體，隨后涂布在0.7%含乙酸的YPDK平板上，獲得了抗酸性能穩(wěn)定提高的突變株。經(jīng)過(guò) 4輪遞歸原生質(zhì)體融合，最終篩選到了一個(gè)乙酸耐受性顯著提高的突變株S4-3。在乙酸體積濃度為0.5%的平板上，突變株S4-3的存活率是出發(fā)菌株GL560的30倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變株抗性提高的機(jī)制可能與細(xì)胞膜完整性和胞內(nèi)CAT活性的提高有關(guān)。基因組重排技術(shù)不必了解菌株的遺傳特性，在細(xì)胞水平上即可進(jìn)行定向進(jìn)化，快速獲得具有優(yōu)良表型的工業(yè)微生物，是一個(gè)十分有效的工具。如今，基因組重排的方法已成功應(yīng)用于多種微生物的脅迫耐受性的改良方面[15-16]。

除了上述幾種成熟的方法外，近年來(lái)，核糖體工程 (Ribosome engineering) 和基因組多重自動(dòng)修復(fù)技術(shù) (Multiplex automated genome engineering，MAGE) 的研發(fā)也將為獲得理想突變表型提供可借鑒的方法。

在微生物細(xì)胞生長(zhǎng)后期都會(huì)面臨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝產(chǎn)物積累的脅迫條件，此時(shí)的環(huán)境條件所引發(fā)的脅迫會(huì)抑制細(xì)胞的代謝活性，不利于生產(chǎn)強(qiáng)度的提高。核糖體是蛋白質(zhì)的合成機(jī)器，也是細(xì)胞感知營(yíng)養(yǎng)水平和對(duì)生長(zhǎng)速率進(jìn)行調(diào)控的重要位點(diǎn)[17]。研究表明，在生長(zhǎng)后期，某些在生長(zhǎng)前期沉默基因 (如編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因) 的激活表達(dá)與核糖體的功能密切相關(guān)，利用“核糖體工程”育種技術(shù)向微生物核糖體中引入特定的突變可獲得抗生素合成能力提高的突變株[18]。微生物可通過(guò)釋放和感知信號(hào)分子控制基因表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境。例如，多種桿菌屬所產(chǎn)生的氨基糖類抗生素 NTD (Neotrehalosadiamine) 就是一種稱為自誘導(dǎo)物的信號(hào)分子，可誘導(dǎo)基因glcP(特異性控制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收)表達(dá)水平顯著上調(diào)[19]，表明 NTD可通過(guò)加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)的吸收來(lái)幫助產(chǎn)生菌在惡劣的環(huán)境中生存，事實(shí)上，這也是選育抗?fàn)I養(yǎng)脅迫突變株的一種嘗試。因此，預(yù)期核糖體工程在獲得抗?fàn)I養(yǎng)脅迫突變株方面會(huì)有重要應(yīng)用。

近來(lái)，《Nature》雜志報(bào)道了一種稱為基因組多重自動(dòng)修復(fù)技術(shù)的高速獲得理想細(xì)胞表型的新方法[20]。Wang等[20]從大腸桿菌的4 500個(gè)基因中選取了有可能改善番茄紅素生物合成能力的24個(gè)基因，將它們的DNA序列分割成易于處理的90個(gè)字母的片段，進(jìn)行基因修飾后，每個(gè)片段都攜帶了單一的突變。利用這些特定序列，研究人員制成數(shù)千個(gè)獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)，通過(guò)電轉(zhuǎn)化，將它們重新插回細(xì)胞。通過(guò)加速重組，研究小組在 3 d內(nèi)創(chuàng)造出多達(dá) 150億個(gè)基因突變體，并使番茄紅素的產(chǎn)量提高了5倍，而用傳統(tǒng)的克隆技術(shù)產(chǎn)生 150億個(gè)突變需要花費(fèi)數(shù)年時(shí)間。美國(guó)加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校的生物工程學(xué)家Liao指出：“這是一種普遍適用的方法”。因此有理由相信，隨著人們對(duì)脅迫抗性相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，利用MAGE平臺(tái)將有力助推工業(yè)微生物脅迫抗性突變株的構(gòu)建。

2.2 確定導(dǎo)致這一表型的遺傳基因

應(yīng)用反向生理功能工程，第二步是快速找出突變表型所對(duì)應(yīng)的基因型。目前可以采用的技術(shù)包括“組學(xué)”技術(shù)、人工轉(zhuǎn)錄因子工程 (Artificial transcription factor engineering) 和文庫(kù)富集尺度分析技術(shù) (Scalar analysis of library enrichments，SCALEs) 等。

“組學(xué)”技術(shù) (基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)、代謝通量組學(xué)等) 在表型表征中起著極為重要的作用。例如，Hirasawa等[21]利用基因微陣列技術(shù)，在乙醇體積濃度為5%的條件下，對(duì)一株具有較高乙醇脅迫抗性的工業(yè)菌株釀酒酵母IFO2347和一株實(shí)驗(yàn)室菌株釀酒酵母FY834進(jìn)行基因表達(dá)譜的描繪。隨后對(duì)基因微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，將目的基因的搜索范圍從 6 000個(gè)基因降至400個(gè)基因。構(gòu)建了這 400個(gè)基因的缺失突變株，測(cè)定所有突變株對(duì)乙醇脅迫體積濃度為 5%時(shí)的敏感度，最終找出色氨酸合成基因可能是與乙醇脅迫抗性密切相關(guān)的基因。向培養(yǎng)基中添加色氨酸、過(guò)量表達(dá)色氨酸透性酶基因，均能增加酵母細(xì)胞對(duì)乙醇脅迫的抗性。并且，過(guò)量表達(dá)色氨酸合成基因的FY834突變株，對(duì)乙醇脅迫的抗性與菌株 IFO2347相當(dāng)。這些進(jìn)一步的研究結(jié)果驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的正確性。這是基于“轉(zhuǎn)錄組”的代謝工程。

然而，細(xì)胞的生理功能是許許多多基因產(chǎn)品(mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物) 共同參與的網(wǎng)絡(luò)信息調(diào)控的結(jié)果，比如，基因表達(dá)不僅僅是從轉(zhuǎn)錄組到蛋白質(zhì)組的單向流動(dòng)，表達(dá)的蛋白質(zhì)或者是細(xì)胞生化狀態(tài)下其他的變化也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)錄組本身進(jìn)行反饋控制，因而廣泛的基因分析應(yīng)該建立在基因產(chǎn)品的全部水平上，才能對(duì)細(xì)胞的響應(yīng)有更好的理解。為此，不同“組學(xué)”技術(shù)的組合越來(lái)越多地應(yīng)用在代謝工程中。例如，丁醇是一種重要的化工原料和極具潛力的新型生物燃料，然而丁醇對(duì)細(xì)胞具有高毒害性導(dǎo)致丁醇產(chǎn)量不高，這是發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的一個(gè)關(guān)鍵限制因素。Rutherford等[22]對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和代謝物組進(jìn)行了分析，以綜合理解細(xì)胞對(duì)丁醇體積濃度為0.8%的脅迫環(huán)境的響應(yīng)。結(jié)果表明丁醇脅迫會(huì)引發(fā)細(xì)胞呼吸功能的擾動(dòng)、氧脅迫、熱休克和胞外被膜應(yīng)激反應(yīng) (Cell envelope stress)，因而很難通過(guò)敲除或引入某個(gè)基因來(lái)顯著提高對(duì)丁醇脅迫的抗性。進(jìn)一步對(duì)高通量組學(xué)分析技術(shù)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，鑒定出了很多關(guān)鍵的基因靶點(diǎn)，從而為代謝工程進(jìn)一步改造菌種提供了依據(jù)。例如候選基因malE、yqhD和ompF，通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)的缺失突變株，證實(shí)這些突變株對(duì)丁醇的敏感性增加，表明有可能通過(guò)過(guò)量表達(dá)這些基因來(lái)減輕丁醇對(duì)細(xì)胞的毒害。

“組學(xué)”技術(shù)只能分析表型對(duì)應(yīng)的基因型，而人工轉(zhuǎn)錄因子工程和文庫(kù)富集尺度分析技術(shù)可以將獲得期望表型和尋找基因型的過(guò)程“合二為一”，在創(chuàng)造新的基因型的同時(shí)較為精準(zhǔn)地定位靶基因。

天然的序列特異轉(zhuǎn)錄因子通常由 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異地識(shí)別并且結(jié)合其對(duì)應(yīng)的DNA序列，使該轉(zhuǎn)錄因子能夠定位到靶基因；效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通常是一個(gè)激活因子或者抑制因子，能夠激活或者抑制靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，這 2個(gè)結(jié)構(gòu)域是各自獨(dú)立起作用的，于是可以將不同的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域組合在一起，人為地構(gòu)建具有新的序列特異性與作用效果的轉(zhuǎn)錄因子，即人工轉(zhuǎn)錄因子[23]。其中，構(gòu)建特異性的 DNA結(jié)合域是成功構(gòu)建特異性人工轉(zhuǎn)錄因子的核心工作。鋅指蛋白 (Zinc finger proteins，ZFPs) 以其小巧靈活、結(jié)構(gòu)獨(dú)特常作為DNA結(jié)合域的首選結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，ZFPs可以作為揭示特定表型與基因型之間關(guān)系的新工具。Park等[24]將源自酵母ZFP文庫(kù)中的三指和/或四指的ZFP編碼基因隨機(jī)重排，克隆入質(zhì)粒載體pZL1，在大腸桿菌DH5α中表達(dá)，構(gòu)建了一個(gè)ZFP文庫(kù)，在50℃下培養(yǎng)2 h，從1×107個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選出了23個(gè)存活細(xì)胞。從耐熱表型中分離鑒定出10種ZFP，對(duì)其中誘導(dǎo)宿主菌產(chǎn)生抗熱脅迫能力效果最好的T9 ZFP用定位突變法和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)T9 ZFP通過(guò)與目標(biāo)基因 ubiX (編碼輔酶 Q生物合成的基因) 結(jié)合，導(dǎo)致靶基因表達(dá)水平下調(diào)而增強(qiáng)細(xì)胞的耐熱性，接下來(lái)的 ubiX敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

Warnecke等[25]利用“文庫(kù)富集尺度分析”技術(shù)(圖1[26])，控制條件將大腸桿菌K12的基因組DNA切割成精確界定大小的片段，并與質(zhì)粒載體pSMART-LCKAN重組后導(dǎo)入大腸桿菌 Mach1-T1進(jìn)行克隆，構(gòu)建了大腸桿菌的基因文庫(kù)。通過(guò)逐步提高3-HP的濃度來(lái)營(yíng)造脅迫環(huán)境，只有質(zhì)粒中含有3-HP抗性基因的重組細(xì)胞才能存活下來(lái)。抽提質(zhì)粒DNA，與基因芯片雜交，用SCALEs軟件定量分析4×105個(gè)菌落的高精度生長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)，利用已知的代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)EcoCyc、COGs等分析基因-基因交互作用網(wǎng)絡(luò) (Interaction networks)，計(jì)算途徑適應(yīng)度和途徑頻度分析抗性細(xì)胞的代謝途徑，結(jié)果顯示通過(guò)確定受抑制的途徑 (分支酸和蘇氨酸途徑)，對(duì)這些途徑進(jìn)行組合修飾可以顯著提高3-HP抗性 (最高可達(dá) 25倍)，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)編碼個(gè)別酶的基因操作所達(dá)到的水平。

圖1 文庫(kù)富集尺度分析技術(shù)圖解Fig. 1 Overview of SCALEs, which was adapted from Fig. 1 of reference 26. a-b: genomic DNA from wild-type Escherichia coli K12 fragmented to several specific sizes was ligated into vectors creating several libraries with defined insert sizes; c: these libraries were individually transformed into E. coli strain Mach1-T1 used for selections. Each of these libraries each contained enough clones to ensure with >99% probability that the entire genome was represented; d: the pools of transformants were mixed and subjected to selection with decreasing concentrations of 3-HP. Only clones bearing plasmids with insert increasing fitness survive; e: enriched plasmids were purified from the selected population, prepared for hybridization to Affymetrix Genechips. SCALEs algorithm was then used to obtain high resolution growth phenotype data; f: genetic level fitness data were mapped according to various definitions of gene-gene interaction such as metabolic networks from EcoCyc, GOGs, etc.

2.3 通過(guò)遺傳改造使這一表型在特定微生物中表達(dá)

反向生理功能工程的最后一步是把鑒定出的目標(biāo)基因?qū)胩囟ㄎ⑸镏?，使目?biāo)菌株獲得所希望的理想表型。雖然這一研究策略在改造微生物的代謝能力方面已有許多成功的實(shí)例[27-28]，但是，在包括脅迫抗性在內(nèi)的其他生理功能的改造方面至今還未見(jiàn)報(bào)道，這種狀況可能正說(shuō)明反向代謝工程的研究策略并不能完全適用于反向生理功能工程。

3 存在的問(wèn)題與展望

工業(yè)環(huán)境下的微生物總是面臨著不同種類的脅迫。要顯著提高工業(yè)微生物對(duì)生產(chǎn)環(huán)境下脅迫的適應(yīng)能力，需要首先了解微生物應(yīng)答不同脅迫條件的生理機(jī)制，在此基礎(chǔ)上才能發(fā)展出相應(yīng)的方法，改善工業(yè)微生物細(xì)胞的生理功能。對(duì)于那些脅迫機(jī)理研究透徹，關(guān)鍵基因已經(jīng)明確的脅迫生理響應(yīng)過(guò)程來(lái)說(shuō)，可以采用經(jīng)典基因工程的方法，對(duì)個(gè)別基因/途徑進(jìn)行改造。但經(jīng)典基因工程的應(yīng)用中也存在著問(wèn)題，首先，基因的相互依存性會(huì)導(dǎo)致一個(gè)基因的表達(dá)不一定會(huì)帶來(lái)人們所預(yù)期的相關(guān)活性的產(chǎn)生，有時(shí)候還有可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的代謝產(chǎn)生正效應(yīng)或負(fù)效應(yīng)。例如，在前期研究中，為改善乳酸乳球菌的生長(zhǎng)性能，我們以輪枝鏈霉菌染色體DNA為模板，擴(kuò)增得到編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶成熟酶的基因 mtg，將其克隆到乳酸乳球菌NZ9000，結(jié)果與對(duì)照菌 (不含mtg基因) 相比，重組菌不僅胞外pH 明顯升高，而且對(duì)氧的耐受性也得到顯著改善[29]。這種正效應(yīng)表明mtg基因的導(dǎo)入對(duì)乳酸乳球菌的其他代謝途徑產(chǎn)生了較大的擾動(dòng)，需要進(jìn)一步研究代謝網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)理，驗(yàn)證有關(guān)基因或途徑的功能，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，理性地構(gòu)建脅迫抗性突變株。

其次，外源途徑的導(dǎo)入可能會(huì)打破宿主細(xì)胞的代謝平衡，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害效應(yīng)。例如，Martin等將異戊烯焦磷酸途徑導(dǎo)入大腸桿菌生產(chǎn)類異戊二烯，雖然重組菌的類異戊二烯產(chǎn)量較高，但細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到了抑制。Piteraa等[30]采用基因滴度研究方法并結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析代謝物譜發(fā)現(xiàn)，其原因在于內(nèi)源 HMG-CoA還原酶不足以平衡外源途徑的流量，導(dǎo)致中間產(chǎn)物HMG-CoA的積累使碳流量受限。通過(guò)調(diào)節(jié)HMG-CoA還原酶的產(chǎn)生，消除了此途徑“瓶頸”，結(jié)果類異戊二烯產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高。因此，當(dāng)需要對(duì)某條途徑進(jìn)行代謝工程改造時(shí)，可以利用前述的“精確調(diào)節(jié)表達(dá)工程”(Fine-tuning expression engineering) 在途徑表達(dá)和細(xì)胞活性方面尋求最佳平衡點(diǎn)[31]。

脅迫所引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)mRNA、蛋白質(zhì)、代謝流的變化不是孤立存在而是相互聯(lián)系的，單一的“組學(xué)”分析不利于理解細(xì)胞對(duì)于突變的響應(yīng)。如今，基于整體性研究為特點(diǎn)的系統(tǒng)生物學(xué) (Systems biology)的系統(tǒng)代謝工程 (Systems metabolic engineering)已成為改造細(xì)胞復(fù)雜代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有力研究工具，通過(guò)研究所有相關(guān)基因、蛋白質(zhì)間的所有相互關(guān)系，正確選擇微生物遺傳選育的操作點(diǎn)，使微生物的菌種選育更具正突變性，這項(xiàng)技術(shù)已在過(guò)量生成代謝產(chǎn)物方面取得成功[32]?？梢韵嘈牛到y(tǒng)代謝工程技術(shù)定會(huì)為微生物生理功能工程的發(fā)展帶來(lái)新的契機(jī)。隨著更多的重要工業(yè)微生物的基因組序列完成測(cè)序及“組學(xué)”技術(shù)研究的深入發(fā)展，以及計(jì)算生物學(xué)的發(fā)展，有望在不遠(yuǎn)的將來(lái)，能夠利用多尺度多層次的微生物生理功能工程技術(shù)快速探明工業(yè)生產(chǎn)菌株的所有脅迫抗性關(guān)鍵基因，構(gòu)建出更能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件的生產(chǎn)菌株。

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Improving industrial microbial stress resistance by metabolic engineering: a review

Ruiyan Fu1, and Yin Li2

1 School of Tea and Food Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230061, China
2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Metabolic engineering is a technologic platform for industrial strain improvement and aims not only at modifying microbial metabolic fluxes, but also improving the physiological performance of industrial microbes. Microbes will meet multiple stresses in industrial processes. Consequently, elicited gene responses might result in a decrease in overall cell fitness and the efficiency of biotransformation. Thus, it is crucial to develop robust and productive microbial strains that can be integrated into industrial-scale bioprocesses. In this review, we focus on the progress of these novel methods and strategies for engineering stress-tolerance phenotypes referring to rational metabolic engineering and inverse metabolic engineering in recent years. In addition, we also address problems existing in this area and future research needs of microbial physiological functionality engineering.

metabolic engineering, industrial microbes, stress resistance, physiological functionality engineering

代謝工程是微生物菌種改造的平臺(tái)技術(shù)，它通過(guò)修飾和優(yōu)化微生物代謝網(wǎng)絡(luò)與表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，改善細(xì)胞的生理功能，從而將微生物改造成“細(xì)胞工廠”生產(chǎn)有用的物質(zhì)，是一個(gè)極具吸引力的研究熱點(diǎn)。工業(yè)微生物的生理功能包括微生物的代謝能力、關(guān)鍵酶對(duì)終產(chǎn)物反饋抑制或阻遏的脫敏、惡劣環(huán)境下的魯棒性 (Robustness)、對(duì)高濃度底物或產(chǎn)物的耐受性、生產(chǎn)全過(guò)程的適合性 (Fitness) 等[1]。以往的代謝工程研究主要集中在改造微生物的代謝能力方面，而增強(qiáng)生物技術(shù)過(guò)程的產(chǎn)率及生產(chǎn)能力需要的不僅是定向改變代謝流的方向并使通量最大化，微生物的其他生理功能特別是脅迫抗性也需要改造。環(huán)境脅迫是指環(huán)境中不利于生物生長(zhǎng)的因素。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，微生物細(xì)胞會(huì)面臨多種因素的脅迫作用，包括酸脅迫[2]、高溫脅迫[3]、滲透壓脅迫[4]等。這些脅迫誘導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)作用，都有可能影響細(xì)胞的許多重要生理功能，從而影響生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的效率。因此，從工業(yè)應(yīng)用的角度出發(fā)，開(kāi)發(fā)出生產(chǎn)性能良好、對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的主要脅迫因素有高耐受性的超能菌株至關(guān)重要。

February 27, 2010; Accepted: April 29, 2010

Supported by: National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803), Foundation of Human Resource of Anhui Agricultural University.

Yin Li. Tel: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707803)，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)穩(wěn)定和引進(jìn)人才科研資助項(xiàng)目資助。