山羊生長軸各類激素及其受體基因的研究

○北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院 田 璐

山西農(nóng)業(yè)大學 張春香 岳文斌

動物生長發(fā)育調(diào)控是一個高度復雜而精細的生理過程，受多個生長調(diào)控系統(tǒng)的影響，其中，神經(jīng)內(nèi)分泌生長軸各因子（激素、受體、結合蛋白等）及其基因?qū)游锏纳L發(fā)育起著關鍵作用。正常情況下，下丘腦接受體內(nèi)外的信息，釋放促生長激素釋放激素（GHRH）和生長激素（SRIF），調(diào)節(jié)垂體生長激素（GH）的分泌，GH通過與生長激素結合蛋白（GHBP）結合而運輸，與靶器官上生長激素受體（GHR）結合，促使胰島素樣生長因素（IGFS）的產(chǎn)生并進入血液循環(huán)，IGFs再通過與胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）結合轉(zhuǎn)運到全身組織細胞，促使組織細胞的生長與分化。鑒于GHRH、GH、GHR、IGF-I和胰島素樣生長因子蛋白（IGFBPs）在動物生長中的重要作用，許多研究者把它們的基因作為候選基因用來尋找與畜禽生產(chǎn)性能相關的多態(tài)位點，以便在育種中進行標記輔助選擇，提高選種的準確性，加快遺傳進展。截至目前，人們已經(jīng)完成人和鼠生長軸上主要基因的克隆測序，并對這些基因及其蛋白功能進行了詳盡研究。下文綜述山羊生長軸主要基因結構、多態(tài)性及與生產(chǎn)性能的關聯(lián)結果等方面的研究情況。

1.山羊GH基因克隆、定位及多態(tài)性的研究。Yamano等和Yato等先后克隆了山羊GH基因cDNA序列。Kioka等（1989）以牛GH基因cDNA作為探針，得到了Tokara山羊GH基因全序列，它由2 544 bp組成，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，在啟動子中含有順式調(diào)控序列，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游83 bp有TATA盒。山羊GH基因5個外顯子長度分別為13 bp、161 bp、117 bp、162 bp和201 bp；4個內(nèi)含子長度分別為247 bp、227 bp、229 bp和276 bp，外顯子和內(nèi)含子的交界處均符合GT-AG規(guī)則，該研究為山羊GH基因多態(tài)的研究奠定了基礎。

山羊GH基因則是通過比較基因組學技術定位于19號染色體的長臂上（19q22）。在山羊基因組中，山羊GH基因有3個等位基因。Yamano等（1991）發(fā)現(xiàn)山羊GH基因有2個克?。?個克隆（CgGH）包含gGH1基因；另1個克隆 （EgGH） 包含 gGH2和 gGH3基因。CgGH克隆包含491 bp的插入序列，正好位于gGH3基因的上游。從測序結果看gGH基因的兩側(cè)序列有短散布的重復序列（SINEs），CgGH 克隆中有 4個SINEs，EgGH克隆中有8個SINEs，并指出山羊 gGH1、gGH2和gGH3基因因個體不同而數(shù)目不一。目前研究報道較多的是gGH1基因，對于gGH2和gGH3基因沒有見到更多有關報道。

在山羊上，Malveiro等（2001）用PCR-SSCP方法分析奶山羊GH基因5個外顯子，并分析這些多態(tài)位點與奶產(chǎn)量、脂肪和蛋白含量等關系，結果表明：在外顯子1和外顯子2上存在2個等位基因；在外顯子3上存在4個等位基因；在外顯子4上存在6個等位基因；在外顯子5上存在5個等位基因；外顯子4的基因型F/F個體較其他基因型個體在奶產(chǎn)量上有顯著差異（P<0.05）；外顯子5的基因型A/A個體較其他基因型個體在奶產(chǎn)量上有顯著差異（P<0.05）。結果說明，GH基因可作為候選基因用于奶山羊標記輔助選擇。

李美玉等（2004）以多個山羊品種（系）為研究材料，采用PCR-SSCP方法對山羊生長激素基因多個不同位點（225～429、-406～-193、26～239） 進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)3個位點均存在多態(tài)性，并在-406～-193位點，基因型頻率在品種間存在顯著差異（P<0.05）；進一步與體重關聯(lián)分析結果顯示：26～239片段及225～429片段多態(tài)位點對體重的影響都沒有達到顯著水平，但后者DD基因型比CC、CD基因型有更高的斷奶重和周歲重，且差異接近顯著水平。閔令江等（2004）以波爾山羊與魯北白山羊的雜交一代為試驗材料，采用PCR-RFLP技術對GH基因的第一至第二內(nèi)含子進行了研究，基因型與出生重和部分屠體性狀關聯(lián)分析結果表明：基因型僅對胴體重有顯著影響（P<0.05），并且在群體中AB基因型的效應顯著高于AA基因型，在不同性別上卻沒有發(fā)現(xiàn)這種基因型之間的差異。但是在出生重、10月齡屠宰活重、胴體重和凈肉重4個性狀的表達上均發(fā)現(xiàn)AB基因型大于AA基因型的趨勢。

2.山羊GHR基因克隆、定位及多態(tài)性的研究。1987年，Leung等從兔肝臟中提取并純化出GHR，又根據(jù)氨基酸序列首次從兔的肝臟cDNA文庫中克隆出GHR cDNA。隨后人們相繼克隆了人（Accession No.:NM000163）、小鼠（Accession No.:J04811）、 家 鼠（Accession No.:NM010284）、綿羊（Accession No.:NM001009323）、牛（Accession No.:NM176608） 和 豬（Accession No.:X5429）等多種動物的GHR cDNA。但截至目前，GenBank中僅有零星片段報道，Maj等（2003）克隆了山羊GHR基因P1啟動子區(qū)和外顯子1a（Accession No.:AY358031），P1啟動子區(qū)位于450～938 bp，微衛(wèi)星序列位 于 828～855 bp，TATA 盒位于914～919 bp，外顯子1a位于940～1148，屬于非翻譯區(qū)；后來，又克隆了GHR基因的外顯子4序列（Accession No.:AY739707），目前還沒有完整cDNA序列和GHR全序列。山羊和牛GHR基因都位于20號染色體的長臂q17上，并且也與PRLR位于同一區(qū)域。

截至目前，有關羊GHR基因多態(tài)和與生產(chǎn)性能關系的報道很少。Maj等將奶山羊GHR基因的5′調(diào)控區(qū)存在（TG）n多態(tài)，其重復數(shù)為10～30，在奶山羊群體中（TG）14等位基因的頻率最高，達到0.48，而（TG）17等位基因的頻率為0.03，但沒有發(fā)現(xiàn)（TG）13等位基因，與產(chǎn)奶性狀進行了關聯(lián)分析結果表明（TG）n多態(tài)與產(chǎn)奶性狀沒有相關；而張春香等（2007）發(fā)現(xiàn)在南江黃羊和波爾山羊兩個群體中（TG）13的基因頻率較高，其次是（TG）14、（TG）17等位基因的頻率最低，且該多態(tài)對周歲體重影響顯著，基因型BB所對應周歲體重的最小二乘均值顯著高于基因型DD所對應的最小二乘均值（P<0.05）。

3.山羊IGFs基因克隆、定位及多態(tài)性的研究。IGF-I是一個單拷貝基因。成熟的IGF-I是一個較小的多肽，但在哺乳動物中該基因卻相當大，基因組DNA為80~100 kb，由5個或6個外顯子組成，如有5個外顯子，則成熟的多肽是由外顯子2和3之間的區(qū)域編碼組成；如有6個外顯子組成，則成熟的多肽是由外顯子3和4之間的區(qū)域編碼組成。根據(jù)現(xiàn)在的命名，外顯子1和外顯子2是前導外顯子，編碼5'UTR的上游沒有啟動子的CTTAA或TATA序列，但具有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點，含外顯子1的IGF-ImRNA稱為1類啟動子，含外顯子2的IGF-ImRNA稱為2類啟動子，選擇性地拼接到外顯子3。

山羊IGF-I基因的全序列還沒有報道，Mikawa等（1995）克隆了山羊IGF-I基因的不同的外顯子1片段，該片段長4 244 bp，包括外顯子1W、外顯子1和外顯子1A。Sakai等（2001）克隆了山羊IGF-I基因的幾個外顯子片段，包括外顯子3、外顯子4和外顯子6。用DNAstar軟件，將這3個區(qū)的編碼部分連接后，與山羊cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)包含了完整的編碼區(qū)。即山羊的IGF-I基因有6個外顯子，成熟的多肽是由外顯子3和4之間的區(qū)域編碼組成。山羊的IGF-I定位在第5號染色體上的5q31。Yilmaz等研究表明綿羊IGF-I基因5′調(diào)控區(qū)和第1外顯子都有多態(tài)。山羊IGF-I基因多態(tài)研究還未見報道。

4.羊IGFBP3基因克隆、定位及多態(tài)性的研究。IGFBP3是單拷貝基因，牛IGFBP3大約長度10 kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，5′端4 000 bp，539 bp的外顯子1，2 954 bp內(nèi)含子1，227 bp外顯子2，474 bp內(nèi)含子2，120 bp外顯子3，1 049 bp內(nèi)含子3 141 bp的外顯子4，1 547內(nèi)含子4和1 421的外顯子5，其中，外顯子1～4是IGFBP3蛋白的編碼區(qū)。牛的轉(zhuǎn)錄起始點位于起始密碼子上游的137 bp處，該處是一個CAP位點，其上游的26 bp有TATA盒，在5′端到TATA盒之間，沒有發(fā)現(xiàn)CAAT盒，但發(fā)現(xiàn)了包含兩個重疊的假定AP2結合點的一個富含GC的序列元。目前，對山羊IGFBP3一級結構的研究還較少，其全序列還沒有報道。

山羊的IGFBP3基因定位在第4號染色體上，閔令江等（2006）研究了山羊IGFBP3基因F4/R4位點單核苷酸多態(tài)性與體重、體高、體尺和屠體性狀的關系。分析結果顯示，山羊IGFBP3基因F4/R4位點對3月齡體長和胸圍、10月齡體長、胸圍、12月齡體長、斷奶重和眼肌面積有影響；在體尺上，均表現(xiàn)為AG型極顯著地大于GG型（P<0.01），在數(shù)值上均遵循AG>AA>GG；在斷奶重和眼肌面積上，則有AG型顯著大于GG型（P<0.05）。山羊 IGFBP3基因 F4/R4位點對體長、胸圍、斷奶重和眼肌面積發(fā)揮作用可能以超顯性為主。

雖然目前對山羊生長軸主要基因結構、多態(tài)性及與生產(chǎn)性能的關聯(lián)分析等方面研究還很有限，但是隨著肉用山羊業(yè)的發(fā)展，這方面的研究會越來越多。