自體胰島細(xì)胞移植治療大鼠全胰十二指腸切除術(shù)后糖尿病的研究

郭棟，劉全達(dá)，劉國(guó)濤，于永紅，葉進(jìn)冬，葉華虎，王啟偉

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)火箭軍總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 錦州 121001；2.中國(guó)人民解放軍火箭軍總醫(yī)院 肝膽外科，北京 100088；3.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100850）

目前，歐美部分醫(yī)院利用全胰腺切除聯(lián)合自體胰島細(xì)胞移植治療慢性胰腺炎已經(jīng)非常成熟[1-4]，在胰島細(xì)胞移植的途徑上通過門靜脈移植普遍優(yōu)于其他移植部位[5-6]。而國(guó)內(nèi)臨床利用此手術(shù)方式治療慢性胰腺炎的案例較少[7]。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠全胰十二指腸切除術(shù)復(fù)制糖尿病模型，模擬臨床自體胰島細(xì)胞移植治療大鼠糖尿病，為其正式應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SD雄性大鼠30只購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXX-軍）。實(shí)驗(yàn)室光照為12 h晝夜交替，動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在25～28℃，相對(duì)濕度為45%～60%，自由進(jìn)水及攝食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

膠原酶XI、平衡鹽溶液、雙硫腙DTZ、Ficoll 400、RPMI 1640培養(yǎng)基、臺(tái)盼藍(lán)（均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），血糖儀（瑞士羅氏公司），ELISA試劑盒（天津德普DPC公司），糖化血紅蛋白儀（美國(guó)Primus公司），超凈臺(tái)（美國(guó)Sigma公司），低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將8周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。對(duì)照組未作任何手術(shù)及藥物處理，手術(shù)組行全胰十二指腸切除術(shù)，實(shí)驗(yàn)組行全胰十二指腸切除聯(lián)合自體胰島細(xì)胞移植術(shù)。

1.3.2 模型復(fù)制 糖尿病大鼠模型復(fù)制方式借鑒LEE氏法[8-11]，選取8周齡SD雄性大鼠，禁食水24 h。10%的水合氯醛8 ml行腹腔注射麻醉并備皮，固定大鼠后75%酒精腹部消毒。大鼠腹部正中約10 cm切口，探查胰腺被胃十二指腸、橫結(jié)腸及脾臟包繞，眼科鑷提起胃脾及橫結(jié)腸，離斷周圍韌帶充分游離胰腺及周圍臟器。分離胰腺組織與橫結(jié)腸系膜直至暴露門靜脈及脾靜脈根部，分離胰腺組織與門靜脈黏合部，結(jié)扎胰十二指腸動(dòng)靜脈及脾靜脈。按缺血線離斷十二指腸（見圖1）。遠(yuǎn)端十二指腸做荷包縫合進(jìn)行閉合，于近端空腸做側(cè)面切口為吻合口。絲線腸道間斷縫合做腸道吻合。于吻合口遠(yuǎn)端1 cm處做小切口，將提前放置膽道的硅膠管放入十二指腸做膽腸吻合，用7-0絲線將膽道周圍結(jié)締組織與十二指腸漿膜縫合。

1.3.3 胰島分離純化 將胰腺完整從標(biāo)本剪下（所有過程均在冰上操作，降低胰腺組織新陳代謝），平衡鹽溶液清洗后加入青霉素、胎牛血清及1640培養(yǎng)基，無(wú)菌眼科剪盡可能剪碎胰腺。將灌洗好的胰腺碎片組織加入2 ml濃度為1 mg/ml膠原酶XI，放置在38℃的水浴中消化25 min，肉眼下未見到成塊的胰腺組織，加入4℃的平衡鹽溶液終止消化[12-13]。離心機(jī)4℃下1 000 r/min離心2 min，棄去上清液，洗滌2次后1 000 r/min離心3 min，棄上清液。純化采用傳統(tǒng)的密度梯度離心法[14-17]，將4 ml濃度為25%的Ficoll 400溶液（25 g Ficoll 400加入100 ml平衡鹽溶液）與沉淀組織進(jìn)行混勻，然后逐層加入2 ml濃度為23.0%、20.5%、11.0%的Ficoll 400，以2 000 r/min速度離心15 min，離心結(jié)束后取20.5%～23.0%及20.5%～11.0%顆粒介質(zhì)為純化的胰島。加入青霉素、胎牛血清及1640培養(yǎng)基0.5 ml混懸胰島。

圖1 全胰十二指腸切除

1.3.4 胰島計(jì)數(shù) 以雙硫腙對(duì)胰島細(xì)胞進(jìn)行特異性染色，顯微鏡下胰島細(xì)胞染成猩紅色，非胰島細(xì)胞不著色，胰島細(xì)胞直徑＞150 μm為1個(gè)胰島當(dāng)量（islet equivalent quantity, IEQ）[18]。胰島細(xì)胞純度（%）=（雙硫腙染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%[19]。

1.3.5 胰島回輸 用1 ml注射器抽取純化好的胰島細(xì)胞混懸液，以3 ml/min勻速注入大鼠腸系膜上靜脈中，使最終定植入肝臟，注射完畢后棉簽按壓穿刺點(diǎn)5 min。

1.3.6 血糖、C肽、糖化血紅蛋白監(jiān)測(cè) 術(shù)后大鼠隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，出現(xiàn)多飲、多尿、多食、體重下降等糖尿病癥狀即模型復(fù)制成功[20-21]。術(shù)后各組血糖連續(xù)監(jiān)測(cè)15d，實(shí)驗(yàn)組每周監(jiān)測(cè)2次，連續(xù)4個(gè)月。術(shù)后各組糖化血紅蛋白連續(xù)監(jiān)測(cè)4個(gè)月（每個(gè)月監(jiān)測(cè)1次）。實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后15d進(jìn)行高糖刺激，分別監(jiān)測(cè)刺激前、后的血糖和C肽變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組多時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型的可靠性

3組大鼠術(shù)后6 h～15 d的血糖變化比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的血糖有差異（F=8.650，P=0.000）；②3組的血糖有差異（F=125.995，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血糖濃度較手術(shù)組低，實(shí)驗(yàn)組胰島移植后血糖控制較好；③3組的血糖變化趨勢(shì)有差異（F=1119.277，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖濃度與手術(shù)組大鼠血糖濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與空白組大鼠血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

對(duì)手術(shù)組的大鼠血糖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，第5天手術(shù)組大鼠血糖（24.30±2.51）mmol/L與對(duì)照組大鼠血糖（4.94±0.39）mmol/L比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-17.008，P=0.000）。第10天手術(shù)組大鼠血糖（25.48±1.37）mmol/L與對(duì)照組大鼠血糖（5.10±0.29）mmol/L比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-32.370，P=0.000）。從連續(xù)的血糖監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠的血糖水平保持持續(xù)高值狀態(tài)（見圖2），且在術(shù)后日常觀察中發(fā)現(xiàn)大鼠有飲水量、尿量明顯增多等癥狀。因此，本研究通過全胰十二指腸切除術(shù)復(fù)制大鼠糖尿病模型成功。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度比較 （n =10，mmol/L，±s）

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度比較 （n =10，mmol/L，±s）

組別 術(shù)后6 h術(shù)后1 d術(shù)后2 d術(shù)后3 d術(shù)后4 d術(shù)后5 d術(shù)后6 d術(shù)后7 d術(shù)后10 d術(shù)后13 d術(shù)后15 d對(duì)照組4.81±0.374.72±0.344.96±0.464.84±0.305.06±0.454.94±0.395.02±0.334.94±0.425.10±0.295.14±0.195.18±0.37手術(shù)組9.28±1.87 20.58±2.00 22.20±2.60 24.70±1.04 24.60±1.35 24.30±2.51 23.22±1.51 24.24±2.19 25.48±1.37 25.88±0.86 25.72±1.18實(shí)驗(yàn)組8.95±0.88 12.85±0.578.62±0.697.01±0.854.98±0.445.11±0.235.11±0.215.04±0.245.03±0.265.06±0.345.14±0.30

圖2 術(shù)后血糖變化趨勢(shì)比較

2.2 自體胰島細(xì)胞移植后的血糖變化

自體胰島細(xì)胞移植術(shù)后第1天，實(shí)驗(yàn)組與手術(shù)組血糖水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.154，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組下降（見圖2）；實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)血糖濃度＜11mmol/L可持續(xù)至術(shù)后4個(gè)月。

3組大鼠術(shù)后4個(gè)月的血清糖化血紅蛋白比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的血清糖化血紅蛋白有差異（F=4.857，P=0.025）；②3組的血清糖化血紅蛋白有差異（F=7.858，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血糖濃度較手術(shù)組低，實(shí)驗(yàn)組胰島移植后血糖控制較好；③3組血清糖化血紅蛋白變化趨勢(shì)有差異（F=2287.632，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖濃度與手術(shù)組大鼠血糖濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與空白組大鼠血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

持續(xù)4個(gè)月監(jiān)測(cè)3組大鼠血清糖化血紅蛋白，第4個(gè)月手術(shù)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），手術(shù)組升高；實(shí)驗(yàn)組血清糖化血紅蛋白水平維持在（5.28±0.19）%，與對(duì)照組血清糖化血紅蛋白水平（5.23±0.28）%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.114，P=0.298），而與手術(shù)組血清糖化血紅蛋白（14.70±1.01）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-20.978，P=0.000）。見圖3。

表2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血清糖化血紅蛋白比較（n=10，%，±s）

表2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血清糖化血紅蛋白比較（n=10，%，±s）

組別 術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月 術(shù)后4個(gè)月對(duì)照組5.10±0.305.22±0.564.98±0.635.23±0.28手術(shù)組12.96±1.6513.20±2.5613.54±3.7514.07±4.10實(shí)驗(yàn)組5.24±0.435.01±0.515.30±0.115.28±0.19

圖3 術(shù)后糖化血紅蛋白水平比較

2.3 自體胰島細(xì)胞的活性

分離純化后的胰島細(xì)胞呈類圓形（見圖4A）；雙硫腙染色后胰島細(xì)胞呈猩紅色（見圖4B）；臺(tái)盼藍(lán)染色后胰島細(xì)胞未著色，胰島細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)完整（見圖4C、D）；胰島細(xì)胞純度＞95%。

全胰十二指腸切除聯(lián)合自體胰島細(xì)胞移植術(shù)后15d，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行高糖刺激，刺激后大鼠血糖水平（實(shí)驗(yàn)前5.28±0.30mmol/L、實(shí)驗(yàn)后10min 7.74±0.65mmol/L）未出現(xiàn)明顯波動(dòng)；刺激后血清C肽水平（實(shí)驗(yàn)前0.23±0.02ng/ml、實(shí)驗(yàn)后10 min 0.71±0.07ng/ml）成倍升高。

圖4 各狀態(tài)下的胰島

3 討論

自1977年明尼蘇達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院首用全胰切除聯(lián)合自體胰島細(xì)胞移植術(shù)以來(lái)，國(guó)外多數(shù)醫(yī)院已成功地將此技術(shù)應(yīng)用于臨床[22-24]。而國(guó)內(nèi)臨床自體胰島細(xì)胞移植術(shù)的應(yīng)用報(bào)道不足，某些疾病如慢性胰腺炎手術(shù)切除全胰腺后導(dǎo)致糖尿病治療基本依賴皮下注射胰島素[25]。自體胰島細(xì)胞移植術(shù)后可以更加精確地控制血糖，不僅可以有效降低血糖，而且可以較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的控制血糖，防止因血糖的不穩(wěn)定性導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，對(duì)提高慢性胰腺炎等疾病患者術(shù)后的生活質(zhì)量有顯著效果[26-27]。

本研究結(jié)果表明，大鼠全胰十二指腸切除術(shù)后，血糖在術(shù)后第1天即出現(xiàn)明顯升高，并且在持續(xù)15d的血糖監(jiān)測(cè)中均表現(xiàn)出高血糖狀態(tài)，同時(shí)伴有多飲、多尿等糖尿病癥狀，表明全胰十二指腸切除術(shù)復(fù)制糖尿病模型安全可靠。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)手術(shù)切除全胰腺?gòu)?fù)制大鼠糖尿病模型描述較少，本次實(shí)驗(yàn)為復(fù)制大鼠糖尿病模型提供新方法，同時(shí)為自體胰島細(xì)胞移植的長(zhǎng)期大量研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

自體胰島細(xì)胞移植術(shù)后實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖與手術(shù)組大鼠血糖相比下降明顯，并且維持正常穩(wěn)定狀態(tài)持續(xù)4個(gè)月，表明移植后胰島功能良好。術(shù)后出現(xiàn)的短暫血糖升高，考慮移植的自體胰島處于功能恢復(fù)期，胰島移植2～3 d后血糖逐步平穩(wěn)。自體胰島移植術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組的糖化血紅蛋白與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明自體胰島移植后血糖控制良好。術(shù)后15 d對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行靜脈高糖刺激，發(fā)現(xiàn)刺激后10 min檢測(cè)的血清C肽較刺激前成倍增長(zhǎng)，說(shuō)明自體胰島移植后胰島細(xì)胞的活性良好。胰島細(xì)胞移植入肝臟后依然持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮功能，與解剖關(guān)系、血供、胚胎學(xué)有較大關(guān)聯(lián)。解剖學(xué)上，胰腺組織與肝臟門靜脈毗鄰密切，胰島β細(xì)胞可以通過毗鄰的門靜脈系統(tǒng)可以及時(shí)密切監(jiān)測(cè)并控制血糖，因此經(jīng)門靜脈移植入肝臟后，同樣可以密切監(jiān)測(cè)血糖變化。血供方面，由于胰腺胰島屬于高耗氧組織，而植入門靜脈系統(tǒng)后也同樣可以汲取門靜脈血液中的氧分子。胚胎學(xué)方面，自體胰島細(xì)胞雖然沒有排斥反應(yīng)的發(fā)生，但是細(xì)胞環(huán)境的變化也會(huì)給細(xì)胞生存帶來(lái)或多或少的影響，而從本研究監(jiān)測(cè)大鼠血糖及糖化血紅蛋白的結(jié)果，甚至術(shù)后一定時(shí)間進(jìn)行的高糖刺激分析，自體胰島細(xì)胞功能較為穩(wěn)定且持久，可能和肝臟、胰腺在胚胎期同源于內(nèi)胚層有一定的關(guān)聯(lián)。

全胰十二指腸切除后自體胰島細(xì)胞移植術(shù)治療大鼠糖尿病效果較好，但本實(shí)驗(yàn)使用樣本數(shù)量較少，其結(jié)論仍需大量樣本加以論證。