耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因的研究進(jìn)展

王鳳玲, 侯英榮, 馮秀河

金葡菌是臨床最常見的病原菌之一,在臨床分離菌中分離率位居前列,其中以MRSA臨床意義尤為重要。由于其多重耐藥性和易造成醫(yī)院感染的暴發(fā)流行,已成為臨床抗感染治療的一大難題[1]。金葡菌可引起一系列的化膿性感染、食物中毒及中毒性休克綜合征等,其化膿性感染從小的皮膚感染病變?nèi)绨X、癰到嚴(yán)重的感染如組織壞死、壞死性肺炎、骨髓炎和心內(nèi)膜炎等。其釋放的毒素可引起全身非特異性炎癥反應(yīng),并導(dǎo)致難以控制的敗血癥,嚴(yán)重者造成多器官功能障礙甚至死亡。攜帶毒素因子[如Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(PVL)、中毒性休克素I(TSST-I)、金葡菌腸毒素(SE)]的金葡菌毒力更強(qiáng),與感染后疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。MRSA對抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重且對多種抗生素耐藥,因此MRSA引起的醫(yī)院感染一旦發(fā)生,常難以控制。本文對MRSA耐藥基因及致病毒素基因等作綜述。

一、MRSA耐藥基因

MRSA對β內(nèi)酰胺類的耐藥性系由mecA基因決定,此基因負(fù)責(zé)編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP2a(PBP2a),該蛋白是一種酶,與β內(nèi)酰胺類抗生素的親和力很低,但其生理功能與細(xì)菌本身固有的PBPS相同。PBPS介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁合成過程中肽聚糖的交聯(lián),對細(xì)菌生長繁殖、保持正常形態(tài)起重要的作用。PBPS是β內(nèi)酰胺類抗生素與細(xì)菌結(jié)合的靶位,與抗生素有高度的親和力,β內(nèi)酰胺類抗生素與PBPs共價結(jié)合后使其失去酶活性,使細(xì)菌細(xì)胞壁合成障礙而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。PBP2a起了PBPS功能,使細(xì)菌細(xì)胞壁合成不受影響,維持其細(xì)菌的存活并生長,使MRSA表現(xiàn)出耐藥性[2]。MecA是MRSA耐藥的決定因子,是金葡菌環(huán)狀染色體上一個外來的大小為30～50 kb的插入片段,mecA基因位于葡萄球菌染色體mec盒(Staphylocossal cassette chromosome mec,SCCmec)上,SCCmec包括mec基因復(fù)合體和負(fù)責(zé)移動的染色體重組基因ccr。

mec基因復(fù)合體由結(jié)構(gòu)基因mecA和位于其上游的調(diào)節(jié)基因mec R1和抑制基因mec I組成,三者控制著MRSA耐藥性的表達(dá)程度,其中mecA編碼PBP2a,mecI編碼的抑制因子(MECⅠ蛋白)結(jié)合在mecA基因的啟動子部位,使mecA基因不能被轉(zhuǎn)錄;mecR1在誘導(dǎo)劑(如β內(nèi)酰胺類抗生素)的作用下編碼產(chǎn)生誘導(dǎo)因子 (MECR1蛋白),能夠去除MECI蛋白對mecA的阻遏作用,使mecA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生PBP2a[3]。mec A基因的表達(dá)還受BlaR1和BlaI基因的調(diào)節(jié),研究表明兩者與mecR1和mecI基因有高度的同源性。Mec復(fù)合體分為4種即classA：mecI-mecR1-mecA、 classB： △ISI1272-mecR1-mecA 、classC：IS431L-△mecR1-mecA,其中 C1、C2的 IS431L方向相反、classD：△mecR1-mecA。

染色體盒重組基因復(fù)合體(cassette chromosome recombinases,ccr)由2種位點特異性重組基因(ccrA和ccrB)與其相鄰的orf s組成,位于SCC-mec的近中部,ccrA、ccrB基因編碼的重組酶對于SCCmec的可移動性起重要的作用,ccr分為4種(ccrAB1 、ccrAB2、ccrAB3 和 ccrC),根據(jù) mec復(fù)合體和ccr的不同組合,可將SCCmec分為6型[4],即Ⅰ型 class B mec+type 1 ccr、Ⅱ型 class A mec+type 2 ccr、Ⅲ型 class A mec+type 3 ccr、Ⅳ型class B mec+type 2 ccr、Ⅴ型class C2 mec+type 5 ccr和Ⅵ型classβmec+type 4 ccr,其中Ⅱ、Ⅲ型是醫(yī)院感染MRSA的常見類型,Ⅳ、Ⅴ型社區(qū)感染的常見類型。

研究表明PBP2a產(chǎn)量與MRSA耐藥水平的高低及MIC值并無相關(guān)性,PBP2a產(chǎn)量相同的MRSA的MIC值可相差很大,這提示除了mecA基因外還有其他耐藥基因。femA、f emB、f emC、f emd、femE和f emF是金葡菌染色體上的固有基因,與甲氧西林的耐藥表達(dá)有關(guān),這些輔助基因與mecA基因的協(xié)調(diào)作用產(chǎn)生對β內(nèi)酰胺類抗生素的高度耐藥性,這是由染色體介導(dǎo)的固有耐藥。HmrC、hmeD、chr基因是染色體突變基因,引起金葡菌對甲氧西林的高度耐藥,其機(jī)制尚未明確。另外mecA基因的表達(dá)還受環(huán)境因素如pH、濕度、2價金屬離子及生長溫度的影響。

20世紀(jì)90年代初已開始報道應(yīng)用PCR檢測mecA基因,近年來許多國家已成功檢測到mecA基因并應(yīng)用于臨床。PCR法檢測MRSA具有較高的靈敏度和特異度,操作簡單、準(zhǔn)確、快捷,結(jié)果直觀。按照NCCLS 2004年版建議,凡檢測出mecA基因或PBP2a即可確定為MRSA。由于抗生素種類不斷增加及臨床上應(yīng)用不盡合理,MRSA引起的感染呈逐年上升趨勢,且MRSA多重耐藥性日趨嚴(yán)重,所引起的全身感染的病死率高達(dá)50%以上。文獻(xiàn)報道1993年日本Cansai醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院MRSA分離率為 41.0%,1999年英國30個監(jiān)測中心MRSA檢出率高達(dá)56.7%,1999年美國疾病控制中心(CDC)統(tǒng)計全美重癥監(jiān)護(hù)病房內(nèi)感染患者M(jìn)RSA陽性率占 53.2%。我國MRSA的感染率也相當(dāng)高,1997年我國臺灣臨床上MRSA的檢出率占70.7%,1998年上海地區(qū)的MRSA分離率為70.7%,1997年北京檢出率為52.9%,提示MRSA引起的感染已非常普遍。

二、PVL及PVL基因

PVL是金葡菌產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素,PVL、γ溶血素和其他殺白細(xì)胞素均屬于synergohymenotropic毒素家族。PVL由兩種蛋白質(zhì)組成,即S和F蛋白(LukS-PVT LukF-PV),其分子量分別為34 ku和33 ku,兩種組分各有不同的生物活性和功能,對人體的多形核白細(xì)胞(PMNs)和巨噬細(xì)胞具有高度的特異性,F蛋白和S蛋白之間有36%的氨基酸序列同源性。PVL屬于膜鉆孔毒素家族,Lusk-PV首先與PMNs細(xì)胞膜上的特異性高親和力強(qiáng)的受體結(jié)合,LukF-PV再與之結(jié)合形成二聚體,然后依次Luks-PV和LukF-PV結(jié)合最后形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雜聚體。此環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)徑3 nm,外徑9 nm,分子量大約為200 ku,其中所含Luks-PV和LukF-PV的克分子比為1∶1,此雜聚體插入到PMNs細(xì)胞膜上,形成一個大約直徑2 nm的穿膜孔,此孔與細(xì)胞膜的平面垂直[5]。PVL通過誘導(dǎo)PMNs壞死或凋亡使細(xì)胞死亡,這依賴于PVL的濃度。在低濃度時,PVL特異地與尚未明確的細(xì)胞表面受體結(jié)合,產(chǎn)生較多的雜聚體孔道,有利于其他的PVL分子進(jìn)入細(xì)胞,在線粒體外膜上建立孔道,破壞線粒體的內(nèi)環(huán)境,激活caspase-9和caspase-3,釋放殺白細(xì)胞素C,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。而在高濃度時,PVL可能非特異地吸附到脂質(zhì)雙層上,形成較大的八聚體孔道,當(dāng)Lusk-PV與PMNs結(jié)合時,蛋白激酶A或C磷酸化Lusk-PV,激活Ca2+通道,Ca2+內(nèi)流而產(chǎn)生白細(xì)胞介素和炎性介質(zhì),使PMNs溶解,釋放出氧化代謝產(chǎn)物和炎性介質(zhì)引發(fā)一系列炎癥反應(yīng),嚴(yán)重者造成組織壞死。

PVL是由2個基因編碼,即 Luks-PV基因和LukF-PV基因,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些葡萄球菌噬菌體上有PVL基因,這些噬菌體可特異地插入到金葡菌染色體上,該位點與SCCmec插入位點不同,業(yè)已表明,PVL基因能為金葡菌提供SCCmec插入、生存所必需的適合結(jié)構(gòu),PVL基因可通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)菌中傳播。約2%的醫(yī)院感染MRSA菌株攜帶 PVL基因[7],而大約3/4的社區(qū)MRSA(CA-MRSA)分離株攜帶PVL基因。

產(chǎn)PVL的金葡菌毒力非常強(qiáng),常與皮膚、軟組織化膿性感染相關(guān),特別是蜂窩組織炎、膿腫和癤腫等疾病,從這些疾病患者獲取的金葡菌PVL陽性率達(dá)50%～93%,引起甲溝炎的金葡球菌中PVL陽性率為13%。嚴(yán)重者可導(dǎo)致組織壞死和壞死性肺炎,而壞死性肺炎常暴發(fā)性起病,病死率很高。據(jù)報道,2005年12月英國由產(chǎn)PVL的MRSA引起的壞死性肺炎致使2例患者死亡。PVL陽性金葡菌感染者(平均年齡14.8歲)比PVL陰性感染者(平均年齡70歲)更年輕。Diep等[8]研究顯示,總共收集的671株金葡菌中,PVL陽性率為33.5%(225/671),其中約有1/3醫(yī)院感染 MRSA菌株和 2/3 CA-MRSA菌株的PVL陽性,而相應(yīng)的MSSA菌株中的PVL陽性率卻低于7%。余方友等[9]研究顯示,195株金葡菌中PVL陽性率為13.3%,其中121株MRSA中 PVL基因陽性率為15.7%(19/121),74株MSSA中的PVL基因陽性率為9.3%(7/74)。許多研究結(jié)果表明MRSA菌株中PVL陽性率高于MSSA。目前MRSA耐藥性日趨嚴(yán)重且呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象,加之大多數(shù)患者具有基礎(chǔ)疾病,機(jī)體免疫力降低,若再感染了毒力強(qiáng)的產(chǎn)PVL的MRSA,其預(yù)后更加不良。由于MSSA的耐藥性不嚴(yán)重,所引起的感染往往被臨床忽視,可能會造成不良后果。

三、TSST-Ⅰ及 TSST-Ⅰ基因

金葡菌引起人類各種疾病,其中中毒性休克綜合征(toxic shock syndrome,TSS)因多器官受累,病死率高而備受重視。TSST-Ⅰ是由噬菌體Ⅰ群MSSA產(chǎn)生的外毒素,是一種多肽蛋白質(zhì),屬于致熱原性超抗原家族,它的超抗原活性很強(qiáng),而分子量很小,約22 ku,DNA序列有708對堿基,585對堿基編碼194個氨基酸殘基,等電點為7.2。TSST-Ⅰ和金葡菌腸毒素A有34%氨基酸同源。TSST-Ⅰ具有2個亞單位(A、B)多肽鏈結(jié)構(gòu),其A 亞單位是毒素的活性中心,決定毒素的致病性與作用方式,多具酶的活性,通過作用于細(xì)胞內(nèi)的靶點而發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng),B單位能與靶細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合,它決定毒素對宿主細(xì)胞的選擇親和性。TSST-Ⅰ不經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理,而是以完整蛋白質(zhì)的分子直接結(jié)合到細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHCⅡ)類分子抗原結(jié)合槽的外側(cè),形成的復(fù)合物與 T淋巴細(xì)胞抗原受體(TCR)的β鏈V區(qū)結(jié)合,經(jīng)磷酯酰肌二醇二磷酸和環(huán)磷酸鳥苷信號傳導(dǎo)途徑激活T淋巴細(xì)胞使其活化、增殖,并釋放大量的炎性細(xì)胞因子如 IL-1、IL-2 、INF-γ、TNFα、TNFβ等引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,最終導(dǎo)致炎癥失控和多器官的損害。由于TCR的β鏈V區(qū)僅存在有限的基因,核苷酸序列非常保守,同一個體內(nèi)的許多T淋巴細(xì)胞可具有相同的β鏈V區(qū)成分,因此極低濃度TSST-Ⅰ即可激活大量的T淋巴細(xì)胞(可達(dá)全部T淋巴細(xì)胞的53%～0),而常規(guī)抗原只激活0.01%～0.1%的淋巴細(xì)胞[10]。TSST-Ⅰ還能直接損害庫普弗細(xì)胞,抑制內(nèi)毒素脫顆粒反應(yīng),使內(nèi)毒素在體內(nèi)蓄積;擴(kuò)大內(nèi)毒素的致死效應(yīng)105～106倍,2 μ g的內(nèi)毒素進(jìn)入人體可引起內(nèi)毒素休克,而在TSS患者僅需10-12g水平的內(nèi)毒素即可發(fā)生嚴(yán)重的低血壓和休克,這稱之為級聯(lián)效應(yīng);TSST-Ⅰ還可增加血管透性,抑制B淋巴細(xì)胞,減少特異性抗體產(chǎn)生等途徑介導(dǎo)休克。

TSST-Ⅰ由 TSST-Ⅰ基因編碼,位于細(xì)菌染色體上,全長 702 bp,編碼 234個氨基酸,當(dāng)金葡菌攜帶的 TSST-Ⅰ基因被激活時,即產(chǎn)生 TSST-Ⅰ毒素,該基因僅存在于5%～15%的金葡菌的菌株之中,其他在人體內(nèi)無害生存的菌株不具有 TSST-Ⅰ基因,該基因由一個被稱為附屬基因調(diào)節(jié)器的整體系統(tǒng)來控制,該系統(tǒng)控制很多分泌蛋白的產(chǎn)生,而某種蛋白在其細(xì)胞外濃度達(dá)到一定水平時觸發(fā)TSST-Ⅰ基因活性,這就是TSST-Ⅰ毒素的產(chǎn)生受細(xì)菌密度影響的原因。

TSST-Ⅰ可引起機(jī)體發(fā)熱、脫屑性皮疹及休克,并增加對內(nèi)毒素的敏感性,感染產(chǎn)毒菌株后可引起機(jī)體多個器官系統(tǒng)的功能紊亂或 TSS病,病死率高。20世紀(jì)80年代早期TSS多見于月經(jīng)期使用衛(wèi)生棉塞或衛(wèi)生栓的婦女中,因而提名為月經(jīng)相關(guān)性TSS?，F(xiàn)在TSS不僅在年輕月經(jīng)期婦女中發(fā)生,而且非月經(jīng)期的婦女、男性及兒童也可發(fā)病。Recsei[11]等首先發(fā)現(xiàn)了非月經(jīng)性TSS即流行性感冒相關(guān)性TSS,所致感染雖然輕微,無明顯發(fā)熱,但在兒童中死亡率極高可達(dá)90%。20世紀(jì)80年代以后的文獻(xiàn)報道,燒傷、鼻部手術(shù)后、膿腫、皮膚移植、外科手術(shù)發(fā)生感染后也能并發(fā)TSS。王慎[12]等對20例具有典型新生兒出疹病的患兒觀察研究,發(fā)現(xiàn)患兒體內(nèi)均有MRSA寄殖,并且都產(chǎn)生TSST-Ⅰ,但臨床癥狀與TSS不符,因此命名為新生兒中毒性休克綜合征樣出疹病。國外曾有人報道,臨床MRSA感染菌株中約50%伴有腸毒素和(或)TSST-Ⅰ產(chǎn)生,其中絕大多數(shù)為耐藥菌株。王敏等[13]研究顯示,共收集的84株金葡菌中,TSS T-Ⅰ基因陽性率為19.05%(16/84)。祁偉等[14]研究結(jié)果顯示,總共收集的112株 MSSA中 TSST-Ⅰ基因陽性率為20.5%(23/112),MSSA TSS T-Ⅰ基因陽性與TSST-Ⅰ表達(dá)兩者之間的一致性大于99%。不僅引起TSS的金葡菌產(chǎn)TSST-Ⅰ,而且引起其他疾病的金葡菌株也能產(chǎn)TSST-Ⅰ,這些產(chǎn)TSST-Ⅰ的金葡菌株無疑對患者特別是對那些免疫功能缺陷不能產(chǎn)生特異性抗體者構(gòu)成了潛在的威脅。

目前MRSA耐藥性日趨嚴(yán)重且呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象,加之大多數(shù)患者具有基礎(chǔ)疾病,機(jī)體免疫力降低,若再感染了毒力強(qiáng)的產(chǎn) PVL和 TSST-Ⅰ的MRSA,增加了臨床治療的難度,其預(yù)后更加不良;金葡菌的耐藥性相對不嚴(yán)重,所引起的感染往往被臨床忽視,可能會造成不良后果。

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