細(xì)菌的耐藥性與適應(yīng)性

李 穎, 楊 帆

一些臨床重要病原菌耐藥性的迅速增長對抗感染治療構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,尋找細(xì)菌耐藥性增長的原因及相應(yīng)防治措施成為當(dāng)務(wù)之急。目前認(rèn)為細(xì)菌耐藥性的傳播主要取決于病原菌(細(xì)菌本身的適應(yīng)性)、抗菌藥物(抗生素選擇壓力)和宿主(免疫力)3個(gè)因素的相互作用[1-2]。眾多研究表明細(xì)菌耐藥性的增長與抗生素的選擇壓力有關(guān),但過去很長一段時(shí)間的研究更多關(guān)注抗菌藥物的抗菌活性和細(xì)菌耐藥機(jī)制。近年來對于細(xì)菌耐藥性與其適應(yīng)性關(guān)系的研究為分析細(xì)菌耐藥性增長的原因和探討如何降低耐藥性提供了新的視角,成為感染性疾病領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

適應(yīng)性(fitness)一般是指細(xì)菌為了生存與繁殖而調(diào)節(jié)自身代謝以適應(yīng)環(huán)境條件(如溫度、pH、滲透壓、抗生素等)的能力[3]。病原體的適應(yīng)性包含以下要素：在感染宿主和環(huán)境中不同菌株的繁殖(競爭)的相對效率;在宿主間的傳播能力;被感染宿主清除的情況[4]。本文主要就細(xì)菌的耐藥性與適應(yīng)性的關(guān)系作一綜述。

一、耐藥菌株的適應(yīng)性代價(jià)

有臨床和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)證實(shí),肺炎鏈球菌在對青霉素的敏感性和其菌株毒力之間存在相關(guān)性。Ho等[5]測定了181株肺炎鏈球菌菌株的藥敏結(jié)果,血流感染分離株中青霉素耐藥肺炎鏈球菌(PRSP)占33.3%,明顯低于其他部位分離株P(guān)RSP比率(73.8%,P＜0.01)。而在免疫功能健全的小鼠體內(nèi),接種野生型(wild)耐藥肺炎鏈球菌并不能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性肺炎[6]。Azoulay-Dupuis等[7]研究了122株肺炎鏈球菌臨床株,其中32株毒力株均對青霉素敏感,而41株對青霉素耐藥或敏感性下降的菌株均無毒力,結(jié)果顯示侵襲性肺炎鏈球菌大部分是青霉素敏感的,非侵襲性菌株大多數(shù)是青霉素不敏感的。

在觀察到耐藥細(xì)菌的生長繁殖能力和致病力可能較敏感細(xì)菌低的現(xiàn)象后,國外很多學(xué)者進(jìn)行了許多有關(guān)細(xì)菌耐藥性與適應(yīng)性關(guān)系的研究(表1)。例如T rzcinski等[18]把肺炎鏈球菌青霉素敏感株,和插入青霉素結(jié)合蛋白基因的同源青霉素耐藥株同時(shí)接種于幼鼠鼻腔,并在其后4～5 d通過鼻腔沖洗液觀察兩者數(shù)量比值的變化,結(jié)果青霉素耐藥株在幼鼠上呼吸道定植力與敏感株相比隨著青霉素結(jié)合蛋白耐藥基因的表達(dá)數(shù)目增加而降低。比較腹腔內(nèi)接種青霉素敏感株和插入pbp2b、pbpx基因的同源青霉素耐藥株的小鼠的半數(shù)致死量(LD50),結(jié)果顯示耐藥株的LD50[分別為(6.0±0.6)和(6.7±0.3)log10CFU/小鼠]比敏感株[(2.0±0.6)log10CFU/小鼠]高,耐藥株毒力較敏感株顯著下降[19]。Gillespie等[30]推測PRSP株適應(yīng)性降低的主要原因可能是耐藥性菌株改變了細(xì)胞壁組成,由此導(dǎo)致的細(xì)胞壁合成所需的酶的底物、活性和親和力的變化增加了青霉素耐藥株的代謝負(fù)擔(dān)。適應(yīng)性降低的現(xiàn)象同樣見于喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥耐藥肺炎鏈球菌菌株[20-23]。

對其他細(xì)菌的研究也都顯示細(xì)菌獲得耐藥性突變后可引起其在體外或動(dòng)物體內(nèi)適應(yīng)性降低的結(jié)果。如體外誘導(dǎo)的rpoB基因突變耐利福平結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC9360),與其同源敏感株共同孵育后計(jì)算兩者繁殖世代的比值,觀察到突變耐藥株的世代數(shù)較同源敏感株少,也就是說前者的體外競爭繁殖能力較后者低[15]。另外有2項(xiàng)關(guān)于鼠傷寒沙門菌的研究顯示,由于rpsL、rpoB和gyrA基因突變而分別對鏈霉素、利福平和萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門菌的大部分(6株/7株)對小鼠無毒力[8],而由于rpsL基因的核苷酸置換AAA42→AAC而對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性的鼠傷寒沙門菌,核糖體蛋白S12的氨基酸置換(K42N)引起核糖體校對率(rate of ribosomal proofreading)的上升,從而使得蛋白合成和細(xì)菌生長速度減慢,細(xì)菌毒力降低[9]。Kanai等[24]在研究中發(fā)現(xiàn),分離自同一患者分別對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥(23SrRNA基因突變)和敏感的幽門螺桿菌株,在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)未表現(xiàn)出生長速率的顯著性差異,當(dāng)混合培養(yǎng)時(shí),隨著連續(xù)傳代,耐藥株與敏感株菌落數(shù)量的比值逐漸減小,提示耐藥株在適應(yīng)性上有所降低。一項(xiàng)通過測定耐喹諾酮類藥物銅綠假單胞菌的體外生長速率的研究結(jié)果顯示,前者的生長速率較其同源敏感株低[25]。Sánchez等[26]的研究表明,2株體外選擇的多重耐藥銅綠假單胞菌突變株(nalB和nfxB)在水中的生存力,產(chǎn)蛋白酶和菌株毒力均較敏感株有所下降,推測可能是由于外排泵耐藥機(jī)制不僅泵出了抗生素,也泵出了大量代謝產(chǎn)物,增加了菌株的代謝負(fù)擔(dān)。

表1 染色體靶位突變引起的耐藥性相關(guān)適應(yīng)性代價(jià)Table 1.The biological cost of resistance conferred by target-altering chromosomal mutations

除了染色體靶位的突變,腸桿菌科細(xì)菌和其他革蘭陰性菌的耐藥性常由質(zhì)粒介導(dǎo)。也有許多研究報(bào)道了與攜帶耐藥質(zhì)粒相關(guān)的適應(yīng)性代價(jià),Lee等[31]的研究證實(shí)攜帶含有TcR(四環(huán)素耐藥)基因質(zhì)粒pBR322的大腸埃希菌體外生長速率降低。Lenski等[32]分析與染色體靶位突變引起的細(xì)菌適應(yīng)性下降機(jī)制不同的是,攜帶耐藥性相關(guān)質(zhì)粒而導(dǎo)致適應(yīng)性降低的原因可能是質(zhì)粒在缺乏抗生素選擇壓力下不穩(wěn)定狀態(tài)所造成的,這也就使得不攜帶耐藥質(zhì)粒的敏感菌株生長繁殖更多。

這些研究提示細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性常常改變了細(xì)菌的核糖體、DNA旋轉(zhuǎn)酶、RNA聚合酶、細(xì)胞壁等重要結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)菌生長速度、定植能力和毒力等的下降,即細(xì)菌耐藥性的獲得需要付出適應(yīng)性代價(jià)(fitness cost)[33]。因此,耐藥菌株的競爭優(yōu)勢可能僅表現(xiàn)在存在抗生素選擇壓力時(shí),當(dāng)無抗菌藥選擇壓力時(shí)其適應(yīng)性反而可能較敏感株低。

二、適應(yīng)性代價(jià)的補(bǔ)償

多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)耐藥會(huì)引起適應(yīng)性代價(jià),但也有研究觀察到一些無顯著適應(yīng)性代價(jià)的耐藥突變(表1)。如Bj?rkman等[10]的研究發(fā)現(xiàn),rpsL基因突變導(dǎo)致對鏈霉素耐藥的鼠傷寒沙門菌中部分菌株毒力并無明顯降低,在這些菌株同時(shí)發(fā)現(xiàn)了rpsD或rpsE基因突變。一項(xiàng)通過測定體外生長速率評價(jià)競爭莫匹羅星耐藥和糖肽類中介的金葡菌(GISA-2)、莫匹羅星敏感和糖肽類中介的金葡菌(GISA-1)和Mu50菌株生長情況的研究結(jié)果表明異亮氨酰-tRNA合成酶點(diǎn)突變的GISA-2菌株的體外生長繁殖能力無明顯降低[27]。Ramadhan等[29]在研究中比較了對萬古霉素耐藥和敏感的腸球菌的體外最大生長速率,未顯示前者適應(yīng)性降低。

諸多實(shí)驗(yàn)表明,這是由于耐藥菌株進(jìn)一步發(fā)生補(bǔ)償突變,使得其適應(yīng)性恢復(fù)(表2)。如Bj?rkman等[8]發(fā)現(xiàn)由于rpsL、rpoB和gyrA基因突變所致鏈霉素、利福平和萘啶酸耐藥的鼠傷寒沙門菌的多數(shù)(6株/7株)對小鼠無毒力,但這些耐藥菌株很快通過不同形式的補(bǔ)償突變在維持耐藥性的同時(shí)恢復(fù)菌株毒力。經(jīng)過序列分析rpsL基因突變耐藥株存在rpsL基因內(nèi)補(bǔ)償突變(42位點(diǎn)和93位點(diǎn)的ACA序列、AAC序列和CGT序列發(fā)生突變),一些突變株的毒力甚至超過了敏感株,提示可能存在rpsL基因外補(bǔ)償突變機(jī)制。而gyrA和rpoB基因突變耐藥株則通過基因內(nèi)補(bǔ)償突變恢復(fù)了菌株毒力。而由于katG基因突變而對異煙肼產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核分枝桿菌也通過基因外補(bǔ)償突變(高表達(dá)ahpC基因),在維持耐藥性的同時(shí)也恢復(fù)了毒力[34]。

同樣的對于攜帶耐藥質(zhì)粒而使得細(xì)菌適應(yīng)性降低的情況,也有報(bào)道補(bǔ)償突變的發(fā)生。McDermott等[35]的研究證實(shí)攜帶含有 TcR(四環(huán)素耐藥)基因的質(zhì)粒pBR322的大腸埃希菌一開始最大生長速率降低,經(jīng)連續(xù)傳代后獲得了適應(yīng)性補(bǔ)償,由于耐藥質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和數(shù)目并無明顯變化,提示可能細(xì)菌染色體發(fā)生了補(bǔ)償突變。Bouma等[36]的研究也顯示雖然一開始攜帶pACYC184非結(jié)合質(zhì)粒的大腸埃希菌的體外適應(yīng)性是降低的,但當(dāng)在抗菌藥選擇壓力下傳代500代時(shí),細(xì)菌染色體出現(xiàn)了適應(yīng)補(bǔ)償(而非質(zhì)粒本身改變),從而使得細(xì)菌的適應(yīng)性升高。其他研究結(jié)果也提示抗生素選擇壓力存在的情況下,大多數(shù)細(xì)菌通過染色體適應(yīng)性突變從而克服攜帶質(zhì)粒的適應(yīng)性缺陷[30]。

細(xì)菌適應(yīng)性代價(jià)及其補(bǔ)償在不同條件下有其不同的意義。如已知肺炎鏈球菌野生株可以通過PgdA和Adr 2種酶修飾肽聚糖的不同部位,PgdA對N-乙酰葡萄糖胺脫乙?；?Adr乙?；疦-乙酰胞壁酸酯,從而造成對溶菌酶的耐受。Davis等[37]在研究中在溶菌酶 M(LysM+/+)和溶菌酶缺陷(LysM-/-)的小鼠模型中,同時(shí)接種肺炎鏈球菌野生株和pgdAadr突變株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LysM+/+小鼠中野生株占絕對優(yōu)勢,在LysM-/-小鼠中突變株占優(yōu)勢,提示肽聚糖的修飾本身在降低了菌株在無溶菌酶存在條件下的競爭能力,但對溶菌酶的耐受性補(bǔ)償了其在寄殖中適應(yīng)性代價(jià)(通常存在溶菌酶)。

目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為適應(yīng)性代價(jià)意味著耐藥株在無抗生素環(huán)境中適應(yīng)性降低,生長速率較敏感株減慢,然而自然環(huán)境中的競爭使得耐藥菌株需要通過基因進(jìn)化來克服這個(gè)缺陷重新獲得競爭力[30]。很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明盡管有時(shí)在缺乏抗生素的條件下適應(yīng)性降低的無毒力耐藥株會(huì)回復(fù)突變成敏感株,但絕大多數(shù)都出現(xiàn)了通過補(bǔ)償突變(compensatory mutation)即第2位點(diǎn)突變(second site mutation),在不喪失耐藥性的同時(shí)來修復(fù)適應(yīng)性和毒力。這也表明減少抗生素的使用可能并不能使已經(jīng)出現(xiàn)在人體和環(huán)境中的耐藥細(xì)菌消失,第2靶位的補(bǔ)償突變能增加耐藥株的適應(yīng)性,使這些菌株在沒有抗生素的環(huán)境中和敏感株成功競爭[30]。事實(shí)上臨床耐藥株可能已經(jīng)適應(yīng)了環(huán)境,補(bǔ)償了耐藥相關(guān)的適應(yīng)性代價(jià),從而引起耐藥細(xì)菌的廣泛傳播。

表2 染色體突變引起的適應(yīng)性降低的改善和補(bǔ)償Table 2.Compensatory evolution and amelioration of fitness losses caused by chromosomal mutations

對細(xì)菌耐藥性與適應(yīng)性關(guān)系的研究,是對細(xì)菌耐藥監(jiān)測和耐藥機(jī)制研究的重要補(bǔ)充,有助于我們更好理解細(xì)菌耐藥性的發(fā)生機(jī)制和傳播規(guī)律,進(jìn)而探索阻遏細(xì)菌耐藥性上升趨勢的更合理策略。

[1] Nuermberger EL,Bishai WR.Antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae：what does the future hold?[J].Clin Infect Dis,2004,38(Suppl 4)：S363-371.

[2] Bj? rkman J,Nagaev I,Berg OG,et al.Effects of environment on compensatory mutations to ameliorate costs of antibiotic resistance[J].Science,2000,287(5457)：1479-1482.

[3] Laurent F,Lelièvre H,Cornu M,et al.Fitness and competitive growth advantage of new gentamicin-susceptible MRSA clones spreading in French hospitals[J].J Antimicrob Chemother,2001,47(3)：277-283.

[4] Andersson DI,Levin BR.The biological cost of antibiotic resistance[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(5)：489-493.

[5] Ho PL,Que T L,T sang DN,et al.Emergence of fluoroquinolone resistance among multiply resistant strains of Streptococcus pneumoniae in Hong Kong[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(5)：1310-1313.

[6] Azoulay-Dupuis E,Vallee E,Veber B,et al.In vivo efficacy of a new fluoroquinolone,sparfloxacin,against penicillin-susceptible and-resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia[J].Antimicrob Agents Chemother,1992,36(12)：2698-2703.

[7] Azoulay-Dupuis E,Rieux V,Muffat-Joly M,et al.Relationship between capsular type,penicillin susceptibility,and virulence of human Streptococcus pneumoniae isolates in mice[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(6)：1575-1577.

[8] Bj? rkman J,Hughes D,Andersson DI.Virulence of antibiotic-resistant Salmonellaty phimurium[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(7)：3949-3953.

[9] Maisnier-Patin S,Berq OG,Liljas L,et al.Compensatory adaptation to the deleterious effect of antibiotic resistance in Salmonella ty phimurium[J].Mol Microbiol,2002,46(2)：355-366.

[10] Bj? rkman J,Samuelsson P,Andersson DI,et al.Novel ribosomal mutations affecting translational accuracy,antibiotic resistance and virulence of Salmonella ty phimurium[J].Mol Microbiol,1999,31(1)：53-58.

[11] Giraud E,Cloeckaert A,Baucheron S,et al.Fitness cost of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].J Med Microbiol,2003,52(pt 8)：697-703.

[12] Johansson U,Evarsson A,Liljas A,et al.The dynamic structure of EF-G studied by fusidic acid resistance and internal revertants[J].J Mol Biol,1996,258(3)：420-432.

[13] Paulander W,Maisnier-Patin S,Andersson DI.Multiple mechanisms to ameliorate the fitness burden of mupirocin resistance in Salmonella typhimurium[J].Mol Microbiol,2007,64(4)：1038-1048.

[14] Schrag SJ,Perrot V.Reducing antibiotic resistance[J].Nature,1996,381(6578)：120-121.

[15] Billington OJ,McHugh TD,Gillespie SH.Physiological cost of rifampin resistance induced in vitro in Mycobacterium tuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(8)：1866-1869.

[16] Wilson T M,de Lisle GW,Collins DM.Effect of inhA and katG on isoniazid resistance and virulence of Mycobacterium bovis[J].M ol Microbiol,1995,15(6)：1009-1015.

[17] Li Z,Kelley C,Collins F,et al.Expression of katG in Mycobacterium tuberculosis is associated with it growth and persistence in mice and guinea pigs[J].J Infect Dis,1998,177(4)：1030-1035.

[18] Trzcinski K,Thompson CM,Gilbev AM,et al.Incremental increase in fitness cost with increased beta-lactam resistance in pneumococci evaluated by competition in an infant rat nasal colonization model[J].J Infect Dis,2006,193(9)：1296-1303.

[19] Rieux V,Carbon C,Azoulay-Dupuis E.Complex relationship between acquisition of beta-lactam resistance and loss of virulence in Streptococcus pneumoniae[J].J Infect Dis,2001,184(1)：66-72.

[20] Johnson CN,Briles DE,Benjamin WH Jr,et al.Relative fitness of fluoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniae[J].Emerg Infect Dis,2005,11(6)：814-820.

[21] Balsalobre L,de la Campa AG.Fitness of Streptococcus pneumoniae fluoroquinolone-resistantstrains with topoisomerase IV recombinant genes[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(3)：822-830.

[22] Rozen DE,M cGee L,Levin BR,et al.Fitness costs of fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(2)：412-416.

[23] Wolter N,Smith AM,Farrell DJ,et al.Heterogeneous macrolide resistance and gene conversion in the pneumococcus[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(1)：359-361.

[24] Kanai K,Shibayama K,Suzuki S,et al.Growth competition of macrolide-resistant and-susceptible Helicobacter pylori strains strains[J].Microbiol Immunol,2004,48(12)：977-980.

[25] Kugelberg E,Lofmark S,Wretlind B,et al.Reduction of the fitness burden of quinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa[J].J Antimicrob Chemother,2005,55(1)：22-30.

[26] Sánchez P,Linares JF,Ruiz-D í ez B,et al.Fitness of invitro selected Pseudomonas aeruginosa nalB and nfxB multidrug resistant mutants[J].J Antimicrob Chemother,2002,50(5)：657-664.

[27] Hurdle JG,O'Neill AJ,Chopra I.The isoleucyl-tRNA sy nthetase mutation V588F conferring mupirocin resistance in gly copeptide-intermediate Staphylococcus aureus is not associated with a significant fitness burden[J].J Antimicrob Che-mother,2004,53(1)：102-104.

[28] Bj? rkman J,Andersson DI.The cost of antibiotic resistance from a bacterial perspective[J].Drug Resist Updat,2000,3(4)：237-245.

[29] Ramadhan AA,Hegedus E.Survivability of vancomycin resistant enterococci and fitness cost of vancomycin resistance acquisition[J].J Clin Pathol,2005,58(7)：744-746.

[30] Gillespie SH,M cHugh TD.T he biological cost of antimicrobial resistance[J].T rends Microbiol,1997,5(9)：337-339.

[31] Lee SW,Edlin G.Expression of tetracycline resistance in pBR322 derivatives reduces the reproductive fitness of plasmidcontaining Escherichia coli[J].Gene,1985,39(2-3)：173-180.

[32] Lenski RE,Simpson SC,Nguyen T T.Genetic analysis of a plasmid-encoded,host genotype-specific enhancement of bacterial fitness[J].J Bacteriol,1994,176(11)：3140-3147.

[33] Enne VI,Delsol AA,Roe JM,et al.Rifampicin resistance and its fitness cost in Enterococcus faecium[J].J Antimicrob Chemother,2004,53(2)：203-207.

[34] Sherman DR,Mdluli K,Hickey MJ,et al.Compensatory ahpC gene expression in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis[J].Science,1996,272(5268)：1641-1643.

[35] McDermott PJ,Gowland P,Gowland PC.Adaptation of Escherichia coli growth rates to the presence of pBR322[J].Lett Appl Microbiol,1993,17(3)：139-143.

[36] Bouma JE,Lenski RE.Evolution of a bacteria/plasmid association[J].Nature,1988,335(6188)：351-352.

[37] Davis KM,Akinbi HT,Standish AJ,et al.Resistance to mucosal lysozyme compensates for the fitness deficit of peptidoglycan modifications by Streptococcus pneumoniae[J].PloS Pathog,2008,4(12)：e1000241.