動物性食品鎘離子污染檢測技術(shù)研究進展

張海棠，劉耀東，王淑云，王自良

（1.河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

Cd2+不是人體必需元素，可通過食物鏈富集作用危害人類健康，對人體具多器官多系統(tǒng)的毒性作用，自上世紀50年代日本暴發(fā)了由Cd2+引起的“骨痛病”事件后，Cd2+污染問題引起了世界各國的普遍關(guān)注，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將Cd2+列為第三位優(yōu)先研究的食品污染物，聯(lián)合國環(huán)境署（UNEP）、FAO和WHO共同制定的食品污染物監(jiān)測和評價計劃中將Cd2+含量作為必測項目之一，美國毒物和疾病注冊處（ATSDR）把Cd2+列為第六位危害人體健康的有毒物質(zhì)。2005年我國農(nóng)業(yè)部頒布了食品Cd2+最大殘留限量標準（MRL）（GB2762-2005），糧食為0.1～0.2 mg/kg，肉類為 0.1 mg/kg，蛋類為 0.05 mg/kg，蔬菜類為0.05～0.2 mg/kg，水果類為 0.05 mg/kg。目前已建立的動物性食品Cd2+污染檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)的理化分析法和免疫分析法兩類，分述如下。

1 理化分析法

理化分析法主要包括紫外分光光 度 法 （ultra-violet spectroscopy，UV）、電化學(xué)分析法（electrochemical analysis，ECA）、 原 子 吸 收 光 譜 法（atomic absorption spectroscopy，AAS）、電感耦合等離子體法（inductively coupled plasma，ICP）、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法（hydride generation atomic fluorescence spectrometry，HG-AFS）、中子活化分析法（neutron activation analysis，NAA）等。

1.1 紫外分光光度法

UV法是基于被測物質(zhì)對紫外-可見光具有選擇性吸收而進行分析測定的方法。UV法測定樣品中Cd2+時應(yīng)加入顯色劑，Cd2+與顯色劑絡(luò)合成有色分子團，在特定波長下根據(jù)顯色程度的不同與標準系列比較而定量。常用的顯色劑主要有偶氮類、卟啉類、三氮烯類、三苯甲烷堿性染料類及熒光酮類等。UV法操作簡單，但干擾因素較多，選擇性較差[1]。王貴芳等[2]合成了一種新顯色劑4-（4-氯苯重氮氨基）-4'-硝基偶氮苯，并研究了其與Cd2+的高靈敏顯色反應(yīng)，在Triton X-100存在下，于pH 10.5的Na2B4O7-NaOH緩沖介質(zhì)中，Cd2+與試劑形成1:2的橙紅色絡(luò)合物，其最大吸收波長位于558nm處，表觀摩爾吸光系數(shù)為 1.42×105L·mol-1·cm-1，Cd2+的質(zhì)量濃度在0～0.75μg/mL范圍內(nèi)服從比爾定律，所擬方法用于廢水中微量Cd2+的直接測定，結(jié)果與原子吸收光譜法一致。

1.2 電化學(xué)分析法

ECD法主要包括陽極溶出伏安法 （anodic stripping voltammetry，ASV）、示波極譜法（Oscillopolarography）和電位溶出法（potentiometric stripping analysis，PSA）三種。

1.2.1 陽極溶出伏安法 ASV法也稱反向極譜法，其原理是利用電流對時間半微分值對電位的關(guān)系曲線為基礎(chǔ)的電化學(xué)分析方法，具有靈敏度高、分辨率好、儀器價格低廉等優(yōu)點，檢測限可達10-9mol/L。Locatelli等[3]采用三電極系統(tǒng)陽極溶出伏安法，以pH 9.3的氨水-氯化鈉為底液，建立了檢測蛤、貝類、魚類等水產(chǎn)品Cd2+的方法，誤差在3%～6%之間。張海麗等[4]研究報道了飼料中Cd2+的陽極溶出伏安法測定方法，以1-（4-偶氮苯基苯）-3-丙基-三氮烯鍵合硅膠（ABPT-SG）為修飾劑，液體石蠟為粘合劑，制備了ABPT-SG修飾碳糊電極，在pH8.0、濃度為0.2 mol/L的氨水緩沖液中，于-1.2V電位下富集，將Cd2+以Cd-ABPT-SG絡(luò)合物的形式吸附在電極上，Cd2+有一個靈敏的陽極溶出峰，峰電流與Cd2+的濃度在5.0×10-6～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.0×10-8mol/L。

1.2.2 示波極譜法 極譜法是利用極普儀來捕捉被測物質(zhì)在特定電位下產(chǎn)生的不同形式的波，進而對被測物質(zhì)含量進行計算的一種方法。此法響應(yīng)時間短，靈敏度高，但穩(wěn)定性差。肖虹等[5]用示波極譜法測定尿樣中Cd2+含量，用硝酸、高氯酸、鹽酸混合酸消化尿樣，消化液在酸性介質(zhì)中，置極譜儀的三電極系統(tǒng)，樣品溶液在滴汞電極上產(chǎn)生還原電流，于-620 mV處測量Cd2+的峰電流，尿樣中Cd2+的質(zhì)量濃度在 100μg·L-1以內(nèi)與峰電流呈線性關(guān)系，Cd2+的相對標準偏差分別為6.91%，6.45%，檢出限為 1.0μg/L，回收率 為 83.1%～103.5%。丁建文等[6]建立的食品中Cd2+的示波極譜法，已應(yīng)用于食品衛(wèi)生、水質(zhì)衛(wèi)生、職業(yè)病等領(lǐng)域，具有波形好、靈敏度高、結(jié)果準確等優(yōu)點。

1.2.3 電位溶出法 PSA法是在溶出伏安法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的電化學(xué)分析方法，根據(jù)化學(xué)溶出時所用的試劑性質(zhì)不同，分為氧化電位溶出法和還原電位溶出法，分析Cd2+主要應(yīng)用氧化電位溶出法。章建軍等[7]建立的食品中Cd2+含量測定的微波消解-二次微分電位溶出法，檢出限為0.24μg/L，其檢測結(jié)果與原子吸收法無顯著差異。

1.3 原子吸收光譜法

ASS法主要包括火焰原子吸收光譜法（flameatomicabsorption spectrometry，F(xiàn)ASS）和石墨爐原子吸收光譜法（Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry，GFAAS）兩種。

1.3.1 火焰原子吸收光譜法 FASS法是利用火焰將樣品氣化為基態(tài)原子，然后根據(jù)被測元素對特定頻率輻射線的吸收進行分析。該方法具有操作簡單、精確度高、分析速度快、測定高濃度元素時干擾少、信號穩(wěn)定等優(yōu)點，但是也存在霧化效率低、測定過程中樣液用量大、火焰氣體對待測原子有稀釋作用、原子在吸收區(qū)停留時間短等缺陷。盧菊生等[8]建立了雙硫腙螯合型樹脂同時分離富集-火焰原子吸收光度法測定食品及生物樣品中痕量Cd2+的方法，檢出限為 1.3μg/L，相對標準偏差優(yōu)于3.0%。陳新煥等[9]采用微波技術(shù)消解樣品，用FASS法直接測定了出口動物肝中的Cd2+含量，吸光值與Cd2+濃度在0～1.8 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為3μg/L，回收率為97.6%～101.2%。

1.3.2 石墨爐原子吸收光譜法GFAAS法是利用石墨管使樣品原子化，然后根據(jù)被測元素對特定頻率輻射線的吸收進行分析的一種方法。與FASS法相比，該法利用高溫石墨管使樣品原子化，大大提高了樣品原子化效率，靈敏度提高了10～200倍，樣液體積用量減至5～100μL，對Cd2+的檢出限達到2μg/L。其缺點是石墨管耗價昂貴，在線檢測時基體干擾嚴重，需采用標準添加法，費時費力。邱棋偉等[10]采用混合酸體系消解樣品，以 NH4H2PO4+Mg（NO3）2做基體改進劑，建立了畜禽肝組織中Cd2+的GFAAS法。Santos等[11]研究了利用石墨爐原子吸收法測定食品中Cd2+的方法，檢測線達3.3μg/L。

1.4 電感耦合等離子體法

ICP法主要包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（inductively coupled plasma spectrometry，ICP-AES）兩種。

1.4.1 電感耦合等離子體質(zhì)譜法ICP-MS法是利用電感耦合等離子體的高溫電離特性使樣品氣化，將待測金屬分離出來，然后進入質(zhì)譜進行測定。該方法于1980年由Houk等[12]最早報道，由于具有靈敏度高、精密度好、檢出限低、動態(tài)線性范圍寬、譜線干擾少、多元素同時檢測等優(yōu)點，迅速發(fā)展成為一種被廣泛應(yīng)用且受到高度評價的一項新技術(shù)，但其缺點是儀器價格昂貴，且易受污染。馬棟等[13]采用微波消解儀處理血液樣品，115In元素做內(nèi)標，建立了血液中Cd2+的ICP-MS分析方法，檢出限為0.00249μg/L，準確度為90.1%～110.7%，精密度為4.0%～7.9%。

1.4.2 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 ICP-AES法是以感應(yīng)耦合電漿原子發(fā)射光譜儀的電感耦合等離子炬管為激發(fā)光源的一種光譜分析方法。該法具有檢出限低、精密度好、干擾水平低、線性范圍寬和可多元素同時測定等優(yōu)點，但是所需儀器昂貴，靈敏度較ICP-MS稍差。陳偉珍等[14]用微波消解處理樣品，采用ICP-AES法測定食品中Cd2+含量，相對標準偏差RSD＜6%，添加回收率為92.6%～106%，檢出范圍為0.764μg/L～1.537μg/L。

1.5 氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法

HG-AFS法是在樣品消解后，加入能產(chǎn)生新生態(tài)氫的還原劑，將樣品溶液中的待測元素還原為揮發(fā)性的共價氫化物，由氬氣帶入石英原子化器中進行原子熒光測定。該方法具有譜線簡單，靈敏度高，檢出線低，可同時多元素分析等優(yōu)點。Duan等[15]利用Cyanex 923柱分離富集消解樣品，采用流動注射進樣結(jié)合HG-AFS法檢測了茶葉中的痕量Cd2+。彭謙等[16]研究建立了食品中Cd2+的HG-AFS測定法，在最佳測試條件下，最低檢出濃度為3μg/L，相對標準偏差為1.1%～4.7%，樣品加標回收率為93.3%～95.8%。

1.6 中子活化分析法

NAA法是利用中子與待測樣品發(fā)生核反應(yīng)，生成放射性核素，然后測量其放射性活度和能譜，由反應(yīng)截面、中子通量、射線能量和強度以及半衰期，確定待測樣品的成分和含量。該法雖具有微量、快速、準確和同時分析多元素的優(yōu)點，但所需的設(shè)備昂貴。Favaro等[17]報道了采用中子活化分析方法，檢測了巴西不同地域不同收入階層膳食中Cd2+的含量。

2 免疫學(xué)分析法

免疫分析法（immunoanalysis，IA）是以抗原抗體特異性、敏感性、可逆性反應(yīng)為基本原理，以不同的抗原抗體反應(yīng)載體為技術(shù)建立起來的分析方法，包括熒光偏振免疫測定法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、一步競爭免疫測定法（one-step competitive immunoassay，OCIA）、KinExA免疫測定法（KinExA immunoassay，KIA）、膠體金免疫層析試驗測定法（gold immunochromatography assay，GICA）和微懸臂梁免疫傳感器（microcantilever immunosensor，MIS）等，分述如下。

2.1 熒光偏振免疫測定法

FPIA的基本原理是樣品中待測的Cd2+與過量鰲合劑鰲合成可溶性的Cd2+-鰲合劑復(fù)合物后，與已知固定濃度的Cd2+-鰲合劑熒光復(fù)合物共同競爭Cd2+pAb上有限的結(jié)合位點，通過熒光偏振分析儀進行分析建立標準曲線，樣品Cd2+濃度測定結(jié)果與標準曲線對照得出樣品中Cd2+的準確含量。Johnson等[18]最早建立FPIA技術(shù)檢測水樣中的Cd2+含量，檢測范圍為1～100nmol/L，檢測限為1nmol/L，與其它金屬離子的交叉反應(yīng)小于0.5%。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

ELISA采用的是非均相間接競爭模式，其基本原理是樣品中的Cd2+與過量鰲合劑鰲合成可溶性的Cd2+-鰲合劑復(fù)合物后，將其與已包被于酶標板上的包被抗原Cd2+-鰲合劑-載體蛋白復(fù)合物共同競爭Cd2+mAb上有限的結(jié)合位點，反應(yīng)達到平衡后洗脫多余的Cd2+-鰲合劑和Cd2+mAb，然后與酶標二抗反應(yīng)，用酶及其底物顯色系統(tǒng)顯示抗原抗體的結(jié)合情況，進而定量檢測Cd2+在樣品中的含量。Khosraviani等[19]建立了水樣中 Cd2+間接競爭ELISA檢測方法，檢測范圍為 7～500 nmol/L，檢 測 限 為 7nmol/L，與Hg2+具有較強的交叉反應(yīng)，與其它金屬離子交叉反應(yīng)較小。朱曉霞等[20]應(yīng)用所研制的抗Cd2+mAb Aa6株建立了間接競爭ELISA檢測方法，檢測范圍為2.19～86.38μg/L，檢測限為0.313μg/L，除與Hg2+交叉反應(yīng)外，與其它金屬離子的交叉反應(yīng)均小于1%。

2.3 一步競爭免疫測定法

OCIA是在間接競爭ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，又稱為直接競爭ELISA，其基本原理是將Cd2+mAb包被于酶標板，待測樣品中的Cd2+先與過量鰲合劑鰲合成可溶性的Cd2+-鰲合劑復(fù)合物，并與已知濃度的Cd2+-鰲合劑-酶復(fù)合物混合，二者共同競爭固定在酶標板上Cd2+mAb有限的結(jié)合位點，反應(yīng)達到平衡后，洗脫多余的Cd2+-鰲合劑和Cd2+-鰲合劑-酶復(fù)合物，用酶及其底物顯色系統(tǒng)顯示抗原抗體的結(jié)合情況，進而定量檢測Cd2+在樣品中的含量。OCIA比間接競爭ELISA靈敏、簡便，且其操作條件pH值7.0～7.6比間接競爭ELISA pH值7.0～7.2范圍更廣，更易于推廣應(yīng)用。Darwish等[21]建立了OCIA檢測水樣中的Cd2+，其檢測限為0.3μg/L，其它金屬離子濃度對檢測結(jié)果無干擾，與GFAAS具有很好的相關(guān)性。之后，Darwish等[22]又建立了OCIA檢測血清樣中的Cd2+，其檢測限為0.3μg/L，檢測范圍為0.24～100μg/L，與 GFAAS的相關(guān)度為R2=0.984。

2.4 KinExA免疫測定法

KIA是在ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其基本原理是一種計算機控制的流式熒光計，由毛細管流/觀察單元組成并配有多微孔篩，篩子上面由統(tǒng)一大小的小珠堆積形成填充床。小珠表面固化包被抗原Cd2+-鰲合劑-載體蛋白復(fù)合物，樣品中的Cd2+與過量鰲合劑鰲合成可溶性的Cd2+-鰲合劑復(fù)合物，加入一定量的Cd2+mAb并使反應(yīng)達到平衡，平衡溶液快速流過包被有固化抗原的小珠，未結(jié)合的Cd2+mAb與小珠上的固化抗原結(jié)合，加入熒光標記二抗，檢測結(jié)合在小珠上的抗體分子，通過與標準曲線對照分析，進而定量檢測Cd2+在樣品中的含量。Blake等[23]研制成功的KinExA-3000用于Cd2+的檢測，其靈敏度比間接競爭ELISA提高了10～1000倍，目前該技術(shù)仍處于實驗室研究完善階段，在實際工作中尚未推廣應(yīng)用。

2.5 膠體金免疫層析試驗測定法

GICA的基本原理是HAuCl4在還原劑作用下形成膠體金，在膠體溶液pH 8.2條件下，以非共價鍵與Cd2+mAb結(jié)合形成金標抗體（Ab-Au），將金標抗體干燥在玻璃纖維棉上，一端與固定有Cd2+完全抗原（檢測線）和二抗RaMIgG（質(zhì)控線）的硝酸纖維素膜相連，另一端與樣品墊相連。加入待測樣品后，金標抗體重新水化并與樣品相互反應(yīng)，在毛細管的擴散作用下沿著吸水紙方向移動，至檢測線時，若樣品中不含Cd2+，金標抗體就會與完全抗原反應(yīng)而被部分截獲，金顆粒富集而出現(xiàn)明顯直觀的紅色條帶，至質(zhì)控線時，金標抗體與RaMIgG反應(yīng)同樣會出現(xiàn)紅色條帶；若樣品中含有Cd2+，Cd2+已與金標抗體反應(yīng)而占據(jù)了金標抗體上的有限位點，不再與完全抗原反應(yīng)而越過檢測線，不出現(xiàn)紅色條帶，僅在質(zhì)控線與RaMIgG反應(yīng)，金顆粒富集而出現(xiàn)紅色條帶。Sasaki等[24]成功建立了GICA檢測Cd2+方法，檢測限為0.3μg/L，該法特異、敏感、快速、簡便、直觀，但其缺陷是不易定量。

2.6 微懸臂梁免疫傳感器

MIS的基本原理是通過在微懸臂梁的表面固化定量的Cd2+mAb形成生物敏感層，待測樣品中的Cd2+先與過量鰲合劑鰲合成可溶性的Cd2+-鰲合劑復(fù)合物，待測樣品進入生物敏感層后，在微懸臂梁表面發(fā)生抗原抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，其量的多少會引起微懸臂梁產(chǎn)生形變或諧振變化等機械響應(yīng)，其響應(yīng)結(jié)果將通過換能器被轉(zhuǎn)換成電學(xué)信號，通過信號分析進而定量檢測Cd2+在樣品中的含量。Velanki等[25]成功建立的MIS技術(shù)應(yīng)用Cd2+檢測，檢測限達到10-9mol/L。MIS是一種穩(wěn)定、靈敏、準確、重復(fù)性好的檢測篩選方法，具有廣闊的發(fā)展前景，我國該方面的研究剛剛起步，目前實際應(yīng)用較少。

3 小結(jié)

傳統(tǒng)的Cd2+理化檢測方法雖然在動物性食品安全檢測方面發(fā)揮了重要作用，但由于存在需要昂貴的儀器設(shè)備、熟練的專業(yè)人員、煩瑣費時、周期長、費用高、不能現(xiàn)場操作、樣品篩檢量小等缺陷，其應(yīng)用受到了限制。免疫檢測技術(shù)具有簡便、快速、敏感、特異、經(jīng)濟、篩檢量大等優(yōu)勢，便于在實際生產(chǎn)中進行在線檢測，受到了人們青睞和重視，是今后研究的熱點和發(fā)展方向。國外已經(jīng)有部分重金屬檢測試劑盒和試紙條問世，我國在這方面的研究尚屬起步階段，相信在不久的將來我們一定會擁有具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重金屬鎘離子免疫學(xué)快速檢測產(chǎn)品。

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