RGD肽作為藥物靶向配體的研究進展

安蓮效，李 慧，顧月清

（中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009）

RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，是整合素（Integrin）與其配體蛋白相互作用的識別位點。自Pierschbacher等于1984年首次報道纖維蛋白原中所含的RGD序列為細胞識別位點以來，RGD肽及其衍生物就成為眾多學者關注與研究的熱點。人體中最常見的含RGD序列的基質(zhì)蛋白主要有纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、玻璃黏連蛋白、膠原、凝血栓蛋白等[1]。本文僅對近年來RGD肽在腫瘤診斷與治療領域的研究進展作一綜述。

1 RGD肽衍生物與整合素家族

整合素家族是一個由許多結構和功能相似的蛋白質(zhì)所組成的膜受體家族，每個成員的分子都是由α、β兩條鏈（亞基）通過非共價鍵連接形成的跨膜異二聚體糖蛋白，是細胞表面重要的兼具黏附和信號傳導功能的受體[2]。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了由18種α亞基和8種β亞基[3]構成的24種整合素，α和β亞基共同決定整合素的受體特異性。整合素通過胞外域與細胞外基質(zhì)（extracellularmatix，ECM），胞內(nèi)段與細胞骨架、信號轉(zhuǎn)導分子和其他一些蛋白相結合，介導細胞內(nèi)外之間的雙向信號傳遞[4]。一方面，細胞內(nèi)信號通過整合素傳導，使其活化，從而調(diào)節(jié)整合素與細胞外配體的親和力；另一方面，整合素與配體結合后把胞外信號傳入細胞內(nèi)，導致細胞骨架重組、基因表達和細胞分化等。整合素在細胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程中起著重要的調(diào)控作用，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，αvβ3就是其中的一種重要分子。研究表明，整合素αvβ3在骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細胞瘤等多種實體腫瘤細胞表面有高水平的表達[5]。

基于基質(zhì)蛋白中RGD三肽序列能與整合素αvβ3特異結合[6]，研究者們合成了大量含RGD序列的線形或環(huán)形多肽作為整合素αvβ3的拮抗劑。對αvβ3拮抗多肽的構效關系研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)線性RGD肽在體內(nèi)循環(huán)過程中半衰期較短，對αvβ3受體親和力較低，如GRGDSPK阻斷玻璃黏連蛋白對αvβ3受體結合的 IC50僅為 1.2 μ mol/L，且易被蛋白酶降解，其生物活性亦不夠理想。含有2個二硫鍵的環(huán)形RGD多肽對腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞的抑制效力最強，是含單一二硫鍵環(huán)形RGD多肽的20倍，是線形RGD多肽的100倍。環(huán)形RGD多肽由于多價態(tài)可以同時和幾個αvβ3結合，因此較線形RGD多肽有更高的受體結合特異性[7]。此外，通過形成均多聚體或雜多聚體也可提高RGD肽對整合素受體的結合率和選擇性。均多聚體可通過協(xié)同作用和對內(nèi)源性配體的屏蔽作用從而提高其靶向親和性能；雜多聚體則可結合于靶細胞中不同的受體，而提高其在靶組織中的攝取率。

2 RGD肽與腫瘤定位及診斷

2.1 RGD肽介導的放射性核素成像

隨著生長抑素受體顯像劑在臨床上的應用，腫瘤受體顯像越來越受到重視。αvβ3整合素在多種腫瘤細胞表面和新生血管內(nèi)皮細胞上有高表達，而在成熟血管內(nèi)皮細胞和絕大多數(shù)正常器官系統(tǒng)中αvβ3不表達或者少量表達[8]。目前，在各種臨床前腫瘤模型中運用RGD肽對αvβ3整合素的非侵入性成像已被深入研究。因此，可以設計含有RGD序列的多肽，并以放射性核素如125I，131I，111In ，99mTc，68Ga，18F 等[9]標記，利用配體與受體結合具有高特異性、高選擇性及高親和性的特點，使之與特定惡性腫瘤細胞上的整合素受體結合，從而使腫瘤部位得以顯像，將是一類具有潛在臨床應用價值的腫瘤受體顯像劑。

Liu等[10]設計了兩種通過PEG4連接、用18F標記的RGD環(huán)肽：18F-PEG4-c（RGDfk）2及18F-PEG4-E[PEG4-c（R GDfk）]2，實驗證實在膠質(zhì)細胞瘤模型中兩個R GD基團用PEG4連接之后的18F-PEG4-E[PEG4-c（RGDfk）]2比單體能更好地與αvβ3整合素結合，在腫瘤部位信號攝取明顯增強，相對于肌肉、腸及肺的靶與非靶放射性（T/NT）比值明顯增加。用18F-PEG4-E[PEG4-c（R GDfk）]2進行的小動物PET顯像證實這種 R GD肽能特異性地與腫瘤新生血管系統(tǒng)中的αvβ3整合素結合，提供腫瘤新生血管表達的重要信息。由于該示蹤劑與整合素具有高親和性和特異性及在體內(nèi)代謝過程中具有的良好穩(wěn)定性，使其在監(jiān)測腫瘤血管發(fā)生與抗血管生成治療中的應用成為可能。Li等[11]用64Cu標記的兩種RGD肽復合物：R GD肽四聚體和R GD肽八聚體，并在整合素αvβ3高表達的膠質(zhì)細胞瘤動物模型中進行PET成像。他們先以谷氨酸為連接臂將RGD肽連接成聚合體，兩種RGD肽聚合體再通過DOTA（一種螯合劑）進行64Cu標記，然后對無胸腺小鼠腫瘤模型進行小動物PET成像。結果顯示，與R GD肽四聚體相比，R GD肽八聚體對整合素αvβ3有明顯更高的親和力與結合特異性，四聚體和八聚體的IC50分別為 35和 10 nmol/L。且64Cu-DOTARGD肽八聚體在腫瘤部位滯留時間延長，腫瘤部位呈高度攝取，顯像過程中腫瘤清晰可見。這些研究結果表明，64Cu標記的RGD肽在體內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性和較為理想的藥代動力學過程，因此將是一個很有發(fā)展前景的αvβ3受體顯像劑。

2.2 RGD肽介導的熒光染料光學成像

近紅外光（700～1 000 nm）屬于非離子性光源、在生物組織中穿透深度大，受生物組織本底影響少，能夠在不損傷活體動物的情況下，穿透深層組織而產(chǎn)生信號響應，而對組織本身幾乎沒有影響，同時還可以避免同位素可能造成的放射性污染[12]。近紅外染料在實際研究中常與一些靶向片段相連，形成特異性近紅外熒光探針，不僅可以直接或間接監(jiān)控目標分子的體內(nèi)行為，還可用于腫瘤凋亡的近紅外成像、近紅外熒光免疫分析、高效毛細管電泳中生物活性物質(zhì)熒光檢測等方面[13]。將R GD肽與近紅外熒光染料偶聯(lián)，利用RGD肽對整合素αvβ3特異結合的性質(zhì)將有可能實現(xiàn)特定惡性腫瘤的近紅外成像，從而達到實時無損在位監(jiān)測早期惡性腫瘤的目的。

Ye等[14]用A549細胞系篩選得到一系列親和力較強的含RGD序列的多肽（單體和多元R GD衍生物），并以近紅外熒光染料cypate進行標記，結果表明，八元RGD衍生物cypate-[（RGD）4-NH2]2在腫瘤細胞內(nèi)的濃度明顯高于其他衍生物，顯示該顯像劑具有良好的應用前景。Wu等[15]將近紅外熒光染料與RGD環(huán)肽共價結合構建了兩種RGD肽復合物：Cy7-c（RGDyK）和 Cy7-PEG-c（RGDyK），對整合素αvβ3陽性的膠質(zhì)細胞瘤U87MG腫瘤模型進行體內(nèi)成像。研究結果顯示，在腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞等整合素αvβ3高表達的部位有更強的熒光信號，且注射4 h后有最大的T/TN比值。他們還發(fā)現(xiàn)，Cy7-c（RGDyK）在腫瘤部位比 Cy7-PEG-c（RGDyK）有更高的熒光強度。若同時注射阻斷劑c（RGDyK），腫瘤組織幾乎不顯像，說明熒光染料Cy7標記的RGD肽通過受體介導從而實現(xiàn)對整合素αvβ3高表達的腫瘤進行實時在位成像。Chen等[16]將另一種近紅外熒光染料Cy5.5與R GD肽偶聯(lián)進行三維小動物成像，研究結果同樣表明，RGD肽能與整合素αvβ3特異結合，可以應用于整合素表達的無損在位成像及抗整合素治療的實時監(jiān)測。

2.3 RGD肽介導的磁共振成像

磁共振成像（Magnatic resonance imaging，MRI）以其高分辨率及成像參數(shù)的多元性在分子影像的研究方面占有重要優(yōu)勢，對腫瘤的定位、定性、手術方案的制訂及預后的估計都有重要的意義。但靈敏度不高是亟需解決的難題，尋找高親和力的分子探針成為當前分子影像學領域研究的熱點。在新生血管內(nèi)皮細胞表面，整合素αvβ3呈上調(diào)狀態(tài)，而在正常組織的血管含量極少[17]。而且這些增生活躍的內(nèi)皮細胞表面直接與循環(huán)血液接觸，更容易接近藥物，是一種特別適合作為腫瘤血管生成分子顯像的分子靶。因此可將RGD肽耦合磁共振造影劑如釓劑作為特異性靶向探針用于腫瘤血管生成的MR顯像。

Zhang[18]等利用含RGD序列多肽和超小超順磁性氧化鐵（uhrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）耦合成一種新型的特異性探針R GD-USPIO，與USPIO單體相比，人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）對RGD-USPIO的攝取明顯增加，且這種增加能被未耦合的RGD競爭性抑制。使用1.5 T磁共振腫瘤血管生成的成像，尾靜脈注射RGD-USPIO后，在整合素αvβ3高表達的HaCaT-ras-A-5RT3腫瘤部位和低表達的A431腫瘤部位，信號的區(qū)域分辨率非常明顯。說明RGD-USPIO可以有效區(qū)分整合素αvβ3的表達程度的差異。Mulder[19]等應用含R GD序列多肽質(zhì)粒和Gd3+耦合成探針，在6.3T的磁共振掃描儀下可以特異性的顯示腫瘤新生血管，并利用激光共聚焦方法證實了探針結合的部位為表達整合素αvβ3的內(nèi)皮細胞。因此，基于RGD肽與整合素αvβ3的高特異性結合性能，以RGD肽偶聯(lián)磁共振造影劑形成的靶向性探針，從而可以實現(xiàn)對腫瘤血管顯像。

3 RGD肽與腫瘤治療

3.1 RGD肽介導的腫瘤細胞毒藥物治療

傳統(tǒng)的治療腫瘤的藥物普遍存在對腫瘤組織選擇性差，毒副作用大等缺點，如何設計出良好的藥物傳遞系統(tǒng)成為近年來的研究熱點。隨著“腫瘤生長依賴腫瘤血管”學說的提出，腫瘤新生血管靶向受體藥物成為一種新型的、頗有潛力的提高腫瘤療效的途徑。整合素αvβ3是理想的腫瘤靶向治療靶點，其配體RGD肽可以攜帶效應分子特異地與其結合，從而抑制腫瘤生長和新生血管的形成。因此，利用RGD肽將細胞毒藥物靶向至特定腫瘤部位，將是一項頗有應用前景的腫瘤靶向治療技術。

Cao等[20]考察了3H標記的紫杉醇（3H-PTX）與3H標記的R GD肽偶聯(lián)紫杉醇藥物（3H-R GD2-PTX）在MDA-MB-435乳腺腫瘤模型中的生物分布、體內(nèi)代謝等過程，發(fā)現(xiàn)3H-R GD2-PTX比3H-PTX在腫瘤部位攝取更多，滯留時間更長。在使用劑量相同的條件下，RGD2-PTX的治療效果較PTX、RGD肽聯(lián)合治療效果更好。這些研究結果表明，RGD肽靶向的紫杉醇藥物能更有效地選擇性殺傷腫瘤部位的新生血管內(nèi)皮細胞，抑制腫瘤的效果更好。這種靶向配體技術也同樣適用于可以選擇性殺傷腫瘤的其他化療藥物。Xiong等[21]考察了用RGD類似物（RGDm）修飾隱形脂質(zhì)體（stabilized liposomes，SL）上載阿霉素（doxorubicin，DOX）后在腫瘤部位的積聚及向腫瘤細胞內(nèi)傳遞的情況。通過流式細胞實驗和激光共聚焦顯微實驗考察腫瘤細胞對SL包封的DOX（SL-DOX）及RGDm-SL包封的DOX（RGDm-SL-DOX）的結合及攝取情況。結果顯示，與整合素αvβ3高表達的黑色素瘤細胞共同孵育后，與SL-DOX相比，細胞對RGDm-SL-DOX的結合及攝取均顯著增加。這些結果表明，RGDm修飾的SL可作為特定藥物的靶向載體通過受體介導的方式將細胞毒藥物有效靶向至特定腫瘤部位。

3.2 RGD肽介導的腫瘤基因治療

腫瘤的基因治療是將一個治療基因“捆綁”在載體（如經(jīng)過人工改造的、不能傳染、不能復制的病毒載體、脂質(zhì)體或納米粒）上，隨后將這種載有治療基因的載體感染腫瘤患者或腫瘤細胞，使治療基因進入腫瘤細胞，進而摧毀腫瘤細胞。整合素在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在腫瘤誘導的新生血管組織中表達豐富的αvβ3對腫瘤血管的生成起重要作用[22]。將整合素αvβ3作為基因治療的靶點，針對整合素亞基設計一段特異的反義寡核苷酸，并通過轉(zhuǎn)基因載體將其轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞中，從而調(diào)節(jié)整合素αvβ3介導的生物學作用[23]。腫瘤的基因治療目前還面臨著諸多問題，其中如何進一步完善基因治療的運載系統(tǒng)，使攜帶的基因具有更高的靶向性尤為突出。利用RGD肽與整合素αvβ3特異性結合的性質(zhì)，可將 R GD肽與載體偶聯(lián)構建靶向性腺病毒載體[24]，攜帶效應分子靶向性進入腫瘤，直接或間接抑制腫瘤生長和新生血管形成。

Witlox等[25]將含有RGD-4C序列插入溶瘤腺病毒CR Ad AdΔ 24中，在該病毒衣殼纖維蛋白中 knob結構域HI環(huán)處重組上一段RGD肽，重組的Ad5-△24RGD腺病毒對αvβ3和αvβ5整合素趨向性較強，將該腺病毒注射入瘤體內(nèi)，結合腫瘤細胞表面高表達的整合素αvβ3受體，選擇進入存在Rb（視網(wǎng)膜母細胞瘤）途徑缺陷的鼠骨肉瘤腫瘤細胞中，利用腺病毒自身原位復制擴增溶解細胞的能力，溶解原發(fā)癌細胞或移植瘤細胞，從而為治療表達αvβ3和αvβ5整合素的骨肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢瘤、胰腺癌等實體瘤提供一種可行方法。Yang等[26]構建了一種能夠靶向至腫瘤新生血管的RGD肽修飾的陽離子脂質(zhì)體（RGD-Lipo），并作為靶向耐藥相關基因MDRI的siRNA輸送載體。體外實驗結果表明，RGD-Lipo細胞黏附能力顯著增強，并可增加細胞內(nèi)siRNA的轉(zhuǎn)染效果，且使用RGD-Lipo-siRNA有利于提高耐藥細胞對放化療藥物阿霉素的敏感度，并將可能應用于臨床耐藥腫瘤的治療。此外，RGD肽還參與腺病毒結構的改造，從而提高腺病毒轉(zhuǎn)染的效率和選擇性。Okada等[27]將IL-12和Ad RGD偶聯(lián)得到Ad RGD-IL-12與Ad RGD-TNF-α聯(lián)合治療小鼠黑色素細胞瘤，結果顯示用很小的量就能達到更有效的腫瘤消退效果，而且無副作用。

4 RGD肽衍生物及其展望

RGD肽作為整合素及其配體相互作用的識別位點，在腫瘤診斷、治療方面有著很好的應用前景。R GD肽能夠直接誘導腫瘤細胞的凋亡，通過對其人工改造可以減少不良反應，有利于發(fā)揮抗腫瘤效應；放射性核素及近紅外熒光染料標記的RGD短肽也將是一類很有應用前景的腫瘤顯像劑。利用RGD肽與整合素αvβ3的特異結合，將治療效應分子靶向性地導入腫瘤部位，可以有效地減少腫瘤治療中對正常組織或器官的損害；此外，RGD肽還可用于腺病毒結構的改造，從而可以提高腺病毒轉(zhuǎn)染的效率和選擇性。要使RGD肽或蛋白在腫瘤治療方面得到廣泛應用，必須考慮其分子專一性，大多數(shù)細胞可產(chǎn)生幾種不同的整合素，而個別整合素存在于許多細胞上，若對目標無合適選擇性，用RGD化合物或蛋白治療某種疾病可能影響其他身體系統(tǒng)[28]。因此篩選出親和力更高的整合素配體，即含RGD的多肽是關鍵性的問題。隨著噬菌體庫技術的不斷成熟以及新的篩選技術，相信含RGD肽是一類很有前景的腫瘤治療藥物，其在腫瘤診斷和治療方面的應用也會更加深入。

筆者所在實驗室致力于近紅外成像技術在生物醫(yī)學領域中的應用與研究，利用R GD肽對腫瘤細胞的靶向性，連接上摩爾吸收系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高的近紅外熒光染料形成整合素αvβ3受體特異性近紅外熒光探針，通過實驗室自行組裝的近紅外熒光成像系統(tǒng)，從而有可能實現(xiàn)對過量表達αvβ3整合素的腫瘤的實時、在位和無損早期診斷的目的。此外，基于R GD肽的藥物靶向配體性能，將此探針修飾不同的藥物載體，將有可能實現(xiàn)實時、在位監(jiān)測藥物載體在小動物體內(nèi)的的組織分布、代謝過程以及抑制腫瘤生長狀況等。

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