肺癌干細胞研究進展

熊艷蕾 綜述 賈心善 審校

肺癌是當今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率近年來呈明顯上升趨勢，嚴重威脅著人類健康。在我國的許多省市和地區(qū)，肺癌的發(fā)病與死亡近十年來一直居惡性腫瘤之首位。雖然臨床上已經(jīng)聯(lián)合應用手術、化療、放療等治療方案，但肺癌患者五年生存率仍不高，尋找新的治療途徑可能有利于肺癌的預后。

依據(jù)腫瘤干細胞理論推斷，肺癌可能是一種干細胞疾?。壕哂凶晕腋潞蜔o限增殖能力的肺癌干細胞是肺癌發(fā)生的根源；肺癌的復發(fā)、侵襲轉移、耐藥、抗輻射等惡性表型特征都與肺癌干細胞有關。本文綜合了肺癌干細胞最新研究進展及其在肺癌形成中的重要作用，同時為肺癌治療提供了新的思路。

1 肺癌干細胞的發(fā)現(xiàn)與分離

1.1 利用細胞表面的分子標記分選肺癌干細胞 Kim等[1]利用流式細胞儀從大鼠細支氣管和肺泡管結合部（the bronchioalveolar duct junction, BADJ）分離出一群CD45+/Pecam-/Sca-1+/CD34+細胞，其在正常情況下處于靜止狀態(tài)，當體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時發(fā)生增殖，能夠分化為其他類型的肺上皮細胞，表現(xiàn)出明顯的自我更新特性，Kim將其命名為支氣管肺泡干細胞（bronchoalveolar stem cells, BASCs）。體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)K-ras基因（原癌基因）激活可導致BASCs增殖更新；成鼠體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)BASCs在肺癌發(fā)生早期可出現(xiàn)數(shù)目增多和體積增大，與肺癌起始有關，被認為是肺腺癌的靶細胞。最近，Regala等[2]發(fā)現(xiàn)非典型蛋白激酶C （protein kinase C, PKC ）的激活可促進BASCs增殖和向肺癌干細胞的轉化。

Eramo等[3]則認為肺癌干細胞屬于CD133+細胞，然而上述類型肺癌干細胞的致瘤性較弱，在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下需植入1×104個CD133+細胞才能形成腫瘤，這些肺癌干細胞是否具有小鼠BASCs特征，目前尚不清楚。但最近有學者對此提出異議[4]，他們應用免疫磁珠從A549和H446肺癌細胞系中分離出CD133+細胞和CD133-細胞，二者均具備相似的自我更新、侵襲及耐受化療藥物能力。此外，40%以上的CD133+細胞和CD133-細胞均可形成較大克隆，這提示僅表達CD133尚不能作為A549和H446細胞系干細胞的標記物。Hayashi等[5]檢測了CD133在小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細胞系內(nèi)表達，發(fā)現(xiàn)CD133幾乎僅表達于小細胞肺癌細胞系，在非小細胞肺癌細胞系內(nèi)很少表達，且CD133+小細胞肺癌細胞致瘤能力均強于非小細胞肺癌，但由于CD133表達過于廣泛，不應作為分選肺癌干細胞的標記物。

最近Chen等[6]從肺癌標本及肺癌細胞系中分離出了CD133+肺癌細胞（LC-CD133+）和CD133-肺癌細胞（LCCD133-），并發(fā)現(xiàn)高表達OCT4基因的LC-CD133+有明顯自我更新能力和無限增殖潛能，體內(nèi)外放化療實驗均表明，LC-CD133+對放化療抵御能力與OCT4基因表達有關，OCT4是參與調(diào)控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性的最為重要的轉錄因子之一，同時也是體外建立誘導多功能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS）的關鍵基因，作者推斷OCT4基因對于維持 LC-CD133+的干細胞特性和耐化療能力有重要意義。

Giangreco等[7]認為位于近端氣道粘膜下腺體/內(nèi)軟骨環(huán)、神經(jīng)上皮小體和終末細支氣管/支氣管肺泡交叉處的氣道干細胞具有致癌特性，如高增殖能力、多向分化潛能和較長存活壽命。

美國學者[8]應用流式細胞儀從人類肺癌細胞系中分選出醛脫氫酶-1（aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1）陽性的細胞，發(fā)現(xiàn)其具備諸多干細胞特征，并表達CD133；體內(nèi)實驗證明：ALDH1+細胞具備可形成與母代細胞異質(zhì)性相同的腫瘤。此外，免疫組織化學分析303例臨床標本發(fā)現(xiàn)ALDH1的表達與肺癌的分期和分級以及患者預后相關。因此作者大膽推測ALDH1可能是肺癌標記物和肺癌潛在的預后因子。

1.2 利用側群細胞分選法分離肺癌干細胞 加拿大學者Ho等[9]應用Hoechst33342染色和熒光激活細胞分選方法，在6種肺癌細胞株（A549, H460, H23, HTB-58, H441, H2170）中分離出側群細胞（side population cell, SP），并證實SP細胞具有自我更新、分化和高致瘤性的特征，并且發(fā)現(xiàn)其具備干細胞“永生”和處于靜止狀態(tài)的特征，高表達抗凋亡因子和端粒酶mRNA，而標志細胞增生的MCM7基因mRNA表達下調(diào)。因此他們認為肺癌的腫瘤干細胞主要富集在側群細胞組分中，表達 ABCG2等ATP結合盒（ATP binding cassette, ABC）轉運蛋白。

Seo等[10]在研究A549人肺腺癌細胞株腫瘤干細胞AKRICI/C2、TM4SFl、NROBI基因表達時，他們利用SP細胞分選法成功將對數(shù)生長期的細胞分離為SP細胞與非SP細胞，并發(fā)現(xiàn)SP細胞AKRICL/C2、TM4SFl、NROBI基因表達上調(diào)并且具備腫瘤干細胞的生物學特征。

2 肺癌干細胞與肺癌形成

2.1 正常肺臟干細胞突變 從理論上來說，一個正常細胞轉變?yōu)槟[瘤細胞至少要發(fā)生4-7次突變，這需要幾年或是幾十年的時間。干細胞生存期長、分裂慢，最有可能長期受有害環(huán)境影響積聚突變向腫瘤干細胞轉化。肺臟干細胞及前體細胞均有自我更新能力，有充分的時間來接受腫瘤形成所必須的遺傳改變信息。當肺內(nèi)正常干細胞自我更新的調(diào)節(jié)機制受損或肺干細胞積累了惡性變傳遞到肺的前體細胞，使其經(jīng)歷突變后重新獲自我更新能力，都會導致肺干細胞無限增生，最終成肺癌[11]。因此，氣管干細胞方面的研究也顯得較為重要。

賈心善等[12,13]應用5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）對離體的人及大鼠氣管造成損傷，建立了氣管干細胞增殖分化動物模型[14]，對氣管干細胞進行了定位研究。結果顯示：5-FU損傷后，氣管上皮細胞絕大部分脫落，可見少量間隔分布的類似裸核的細胞呈釘狀位于基底膜上，PCNA染色陰性，證明為G0期細胞；去除5-FU后，正是通過這些干細胞增殖分化，修復了損傷的氣管環(huán)。該實驗室還證實，此G0期細胞能排除Hoechst33342染料，Bcrpl/ABCG2表達陽性[15]，Song等[16]發(fā)現(xiàn)此G0期細胞可表達胚胎干細胞標記物Oct3/4、Nanog和Sox2，進一步證明其為氣管干細胞。此外，該損傷模型還可用于研究氣管損傷修復過程中某些信號通路的開啟情況及某些細胞因子的變化情況。

雖然干細胞和腫瘤干細胞密切相關，但應該注意到它們有著本質(zhì)的不同[17]，例如腫瘤干細胞自我更新轉導途徑的負反饋機制已被破壞，傾向于累積復制的錯誤，而干細胞能夠防止復制錯誤的發(fā)展。此外，干細胞增殖具有自穩(wěn)定性，其數(shù)目在機體調(diào)控下保持恒定，而腫瘤細胞卻無自穩(wěn)定性的特點。

2.2 肺臟干細胞微環(huán)境調(diào)控異常 干細胞生長的微環(huán)境稱之為干細胞“龕”（niche），它保持干細胞處于休眠狀態(tài)；阻止其分化；保護腫瘤干細胞免于抗癌藥物、放射線的攻擊；通過信號傳導通路調(diào)節(jié)著腫瘤干細胞的自我更新、分化、凋亡，影響著腫瘤干細胞的遷徙與轉移。

研究[18,19]發(fā)現(xiàn)肺癌的形成不僅與肺癌干細胞有關，肺臟局部微環(huán)境可能也參與肺癌形成，在不同解剖區(qū)域有不同的組織學表型。鼠類肺癌模型由近端氣管至遠端氣管，大致分布的主要肺癌組織表型為：鱗癌、小細胞肺癌、支氣管肺泡癌。這種在不同解剖區(qū)域有不同表型分布的現(xiàn)象提示：僅有少數(shù)散在分離的細胞及其微環(huán)境支持肺癌生長。K-ras基因變異小鼠模型實驗也證實了這一觀點：盡管整個小鼠氣道細胞都發(fā)生了K-ras基因變異，但是僅位于支氣管肺泡區(qū)域的細胞發(fā)生了腺瘤樣增生。此外，肺腺癌是肺癌最常見的組織類型之一并且在細支氣管和肺泡處多發(fā)。這表明：肺癌的形成不僅與致癌基因突變有關，還與不同細胞所處的微環(huán)境有關。利用小鼠鱗癌，腺癌，支氣管肺泡癌模型確定的腫瘤起始位點與最新發(fā)現(xiàn)的氣道干細胞所處的小生境位置似乎一致[20]。

2.3 肺臟干細胞信號轉導機制異常 大量實驗研究證明，正常干細胞和腫瘤干細胞具有相似的調(diào)節(jié)性信號轉導通路，一旦正常干細胞自我更新的信號轉導通路調(diào)節(jié)紊亂則會導致腫瘤增殖或形成腫瘤。目前已經(jīng)清楚腫瘤干細胞的分化與自我更新受EGF/EGFR、PDGF/PDGFR、Notch和Wnt/β-catenin等通路的調(diào)控[21]。

2.3.1 Wnt通路與肺臟干細胞 Wnt/β-catenin通路可以調(diào)控細胞周期，從而維持干細胞的分化和自我更新。王琳琳等應用5-FU大鼠氣管上皮損傷模型，再現(xiàn)了氣管干細胞原位增殖分化修復氣管上皮的全過程，結果表明：Wnt-1時間依賴性表達與氣管損傷修復進程相吻合，Wnt/β-catenin信號傳導途徑參與調(diào)控氣管干細胞增殖分化全過程，修復早期促進氣管干細胞的增殖，修復后期促進祖細胞向特定的細胞分化。張菁茹等[22]采用干細胞基因芯片比較受損氣管上皮在恢復24 h及48 h與正常氣管上皮基因表達的差異。24 h后差異基因8個上調(diào)，31個下調(diào)。48 h后5個上調(diào)，42個下調(diào)。差異基因表達主要集中在細胞周期調(diào)控、細胞連接、FGF、BMP分子、Notch、Wnt信號通路上。在肺干細胞中β-catenin主要通過減弱分化促進組織干細胞數(shù)量的增加，而不是促進干細胞直接增生，其在非小細胞肺癌干細胞中的作用也需要進一步研究[23]。

Mazieres等[24]證實在肺癌細胞信號轉導通路中存在與上述干細胞相似的Wnt過度表達、非經(jīng)典途徑JNK通路激活和Wnt拮抗劑WIF-1的抑制和失活。Nakashima等研究證實，Wnt-1的過度表達會使肺癌發(fā)生演進。Kim等[25]應用轉染后含有 Wnt-1抑制因子基因的A549和H460細胞株，測定細胞增生，并將含有Wnt抑制因子的脂質(zhì)體注射到移植瘤。結果表明Wnt-1抑制因子表達增加可以促進癌細胞的凋亡，使克隆形成率下降，并且重組的Wnt-1抑制因子蛋白能夠抑制 H460的增生，顯著抑制腫瘤的生長。

2.3.2 Notch通路與肺臟干細胞 在非小細胞肺癌干細胞的研究中，敲除小鼠基因的實驗研究[26]表明 Notch通路活化在肺的發(fā)育中起重要作用，并且Notch配體、受體和HES1的水平在非小細胞肺癌細胞株中表達升高，其與癌變的RAS信號關系密切[27]。應用γ-Secretase抑制劑能夠抑制Notch2激活，在體內(nèi)、外均可抑制肺癌的生長[28]。Ma等[29]采用大鼠損傷模型，分析了Notch信號分子Notch-3、Jagged-1和Hey1在氣管干細胞增殖分化過程中的表達。實驗證明，Hey-1的Notch信號在氣管干細胞增殖分化過程中維持氣管干細胞的未分化狀態(tài)，促進氣管干細胞的非分化性增殖。

就肺癌而言，其干細胞和腫瘤形成的關系正逐步揭曉。理論上，我們認為，上述三個條件在肺癌形成過程中均發(fā)揮了作用，但是其具體發(fā)生及調(diào)控機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

3 肺癌干細胞與臨床治療

3.1 肺癌干細胞可能與耐藥性密切相關 目前大量的理論和實驗均表明腫瘤干細胞可能與耐藥性密切相關。與正常干細胞類似，生長緩慢和多處于休眠狀態(tài)有助于腫瘤干細胞耐藥性的產(chǎn)生。此外，腫瘤干細胞表面高表達多種ABC轉運蛋白[30]，例如ABCB1基因編碼P2糖蛋白（P-glycoprotein, Pgp）、ABCG2/MXR基因編碼多藥耐藥相關蛋白1（multi-drug resistance related protein 1, MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白2（bcl-2），它們具備外排藥物、毒物的能力。ABCG2、ABCB1或ABCC1基因敲除的小鼠對長春堿、異阿凡曼菌素、米托蒽醌等藥物更加敏感[31]，提示ABC轉運子可保護細胞不受化療藥物影響，也可能經(jīng)過基因突變的積累，腫瘤干細胞把這種多藥耐藥機制遺傳下來；或存在基因突變或分化異常導致復發(fā)的腫瘤出現(xiàn)了多藥耐藥性，這就可以解釋為什么本來不具有耐藥性的腫瘤在化療后復發(fā)獲得多藥耐藥性。

Sung等[32]也發(fā)現(xiàn) A549細胞株的側群細胞亞群有ABCG2基因高表達，且MDR1和ABCC2基因高表達，并證明了其與腫瘤耐藥性有關。

3.2 肺癌干細胞與肺癌復發(fā) 肺癌傳統(tǒng)治療方案中，放射療法、化學藥物療法等被廣泛應用于包括肺癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤，但是這些手段往往在治療初期效果顯著，但是維持時間短暫且伴有復發(fā)現(xiàn)象。放化療手段殺傷的靶細胞為增殖活躍的肺癌細胞或定向前體細胞，而休眠的肺癌干細胞往往處于G0期，對射線和化學藥物不敏感，可以抵御放化療的殺傷，成為以后復發(fā)的根源[33]，這或許可以解釋當前治療惡性腫瘤失敗的原因。因此針對腫瘤干細胞的治療可能效果更持久，靶向去除肺癌干細胞將是治療肺癌的新突破點。

3.3 清除肺癌干細胞的可能策略 研制ABC轉運蛋白的阻斷劑進而逆轉肺癌干細胞的耐藥性，充分發(fā)揮化療藥物的療效。目前已批準進行臨床研究的ABCG2抑制劑及其它ABCG2抗體的研究等[34]。

通過調(diào)控關鍵的信號通路來抑制肺癌干細胞的自我更新和誘導分化。可以通過小分子抑制劑如RNAi技術阻止這些信號通路的活化來治療腫瘤。目前發(fā)現(xiàn)gamma蛋白分泌酶抑制劑，可以靶向Notch通路來抑制白血病和淋巴瘤細胞的生長[35]。

改善腫瘤干細胞的微環(huán)境 ，特別是血管生成。目前已經(jīng)證實，抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的單克隆抗體-貝伐珠單抗[36]（bevacizumab）對于結腸癌治療有效。抗血管生成治療已經(jīng)應用在非小細胞肺癌的治療中，并使患者的生存獲益[37]。

直接靶定肺癌干細胞，根據(jù)特異性的表面分子標志識別肺癌干細胞，制備單克隆抗體，攜帶放射性物質(zhì)或化療藥物，直接靶向放化療，最終促使肺癌干細胞凋亡，使腫瘤失去生成新的腫瘤細胞的能力，爭取達到根治的目的。通過腫瘤干細胞表面的分子抗原進行靶向殺傷?，F(xiàn)已應用于臨床的吉姆單抗（gemtuzumab）/奧佐米星（ozogamicin）是人源化的抗CD133單抗和細胞毒抗腫瘤抗生素刺孢霉素（calicheamicin）的偶聯(lián)物，用于治療復發(fā)的急性髓性白血病AML。最近發(fā)現(xiàn)抗CD44的單抗可以消除AML干細胞[38]。

4 總結

肺癌干細胞領域的研究剛剛起步，還有許多問題亟待解決。例如：探尋肺癌干細胞的具體生物學特性及其標記物、確定腫瘤干細胞與正常干細胞間的差別、明確其具體調(diào)控機制和信號轉導通路等。但是，這一理論的提出及認定無疑將會是人類攻克肺癌的一大進步，可以解釋肺癌的多種生物學行為，因此結合腫瘤干細胞學說，分析肺癌干細胞的生物學特性，進而闡明肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉移、耐藥的機制，有助于肺癌的診斷、治療和預后評估，有助于篩選靶向性殺傷腫瘤干細胞的藥物，為臨床提供新的治療靶點，將會對肺癌的診斷、治療及預防產(chǎn)生深遠的影響。