高表達FoxO1抑制豬骨骼肌成肌細胞的分化

袁媛，史新娥，劉月光，楊公社

西北農(nóng)林科技大學動物科技學院 動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室，楊凌 712100

FoxO家族是一群擁有保守的 Fork區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠和TTGTTTAC序列相似性高或一致的序列結(jié)合，主要參與DNA修復、細胞分化、凋亡和代謝[1]。FoxOs作為轉(zhuǎn)錄活化因子，其活性受多條信號通路的調(diào)節(jié)，包括胰島素、PI3K/Akt等，其作用方式是對 FoxOs特定的氨基酸位點進行磷酸化/去磷酸化的調(diào)控[2]。FoxOs特異性的氨基酸位點一旦被磷酸化后，將從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，此時便失去轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，其功能亦被抑制，因此 FoxOs在核內(nèi)外的轉(zhuǎn)位決定了其對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[3]。近幾年的研究表明，該家族成員FoxO1在骨骼肌的分化、生長與代謝過程中扮演重要角色，但其調(diào)控方式仍存在爭議，分子機制尚 不清楚。

3.4 腸道菌群與更年期綜合征 更年期綜合征指部分婦女由于卵巢功能衰退或喪失，因性激素波動或急劇減少，引起機體內(nèi)分泌失調(diào)、免疫力低下和植物神經(jīng)紊亂的癥候群，可導致全身多個系統(tǒng)的病理變化[28]。近年來越來越多研究證明，腸道菌群的改變會引起體內(nèi)代謝紊亂，且與高級神經(jīng)精神活動存在密切關系，說明腸道菌群改變可能與更年期的一系列癥候群存在一定關系。郭在清[29]研究結(jié)果顯示，更年期綜合征人群腸道雙歧桿菌數(shù)量顯著減少，腸桿菌科及腸球菌細菌數(shù)量顯著增加，益生菌群與腸桿菌科結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能更年期綜合征人群由于神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)等健康狀態(tài)的下降，引起腸道有益菌群與腐敗菌比例發(fā)生變化，從而引起腸道微生態(tài)失調(diào)。

豬肉是我國肉類生產(chǎn)的主體，目前提高瘦肉率、改善肉品質(zhì)已成為豬育種的主要研究方向。骨骼肌是肌肉的主要組成部分，其生長發(fā)育非常復雜，涉及到大量基因的表達及網(wǎng)絡調(diào)控。FoxO1的表達和活性與骨骼肌的發(fā)育密切相關，但目前關于其在肌肉發(fā)育中的調(diào)控方式仍不十分清楚。因此，本實驗誘導體外培養(yǎng)的豬原代骨骼肌成肌細胞分化，檢測FoxO1在此過程中的表達變化，并通過將FoxO1基因?qū)胴i成肌細胞，探索FoxO1對成肌分化的影響，為進一步揭示FoxO1調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的作用機理奠定基礎。

這主要是指大斷面淺埋偏壓隧道在開始時要注意控制標準面上下部的每循環(huán)開挖尺寸。大體而言，上導洞的每循環(huán)開挖尺寸應控制在0.5m內(nèi)，下導洞視周圍巖石的穩(wěn)定情況定位0.5～1m，保證下部落后于上部約5～10m。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

3日齡健康長白仔豬由西北農(nóng)林科技大學種豬場提供，體重1.5~2.5 kg，取樣前用0.5%的新潔爾滅清洗0.5 h左右，電擊處死。

1.1.2 主要試劑

含目的基因 FoxO1的 pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3由Haojie Huang教授 (Minnesota University，USA) 惠贈。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Opti-MEM (Invitrogen)、G418 (Gibco)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、鏈酶蛋白酶 (Sigma)、胎牛血清 (杭州四季青)、馬血清 (Gbico)、Trizol (TaKaRa)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT-reagent Kit (TaKaRa)、DNAseⅠ(TaKaRa)、實時定量試劑盒 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time) (TaKaRa)、抗FoxO1、P-FoxO1 (Ser256)、MyoD、β-actin和FLAG抗體均購自美國 Santa Cruz公司，抗 myogenin 購自Millipore公司。其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬骨骼肌成肌細胞的原代培養(yǎng)及分化誘導

FoxO1是多條信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生理過程，其活性受到磷酸化/去磷酸化的調(diào)控[5-6]。本實驗室龐衛(wèi)軍及其他學者的研究表明，F(xiàn)oxO1廣泛表達于各種組織器官中，包括脂肪、骨骼肌和肝臟等并能夠抑制脂肪細胞的分化[7-8]。眾多研究證實，F(xiàn)oxO1在肌肉發(fā)育與分化中起到重要作用。Bois等研究指出FoxO1可以促進小鼠原代成肌細胞的終末分化[9]，同年又有研究發(fā)現(xiàn)C2C12小鼠成肌細胞系的分化受到FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的抑制[10]。Kamei等構(gòu)建了骨骼肌特異的FoxO1轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)骨骼肌重量明顯減少[11]。這些研究均表明，F(xiàn)oxO1轉(zhuǎn)錄因子在骨骼肌的分化中扮演重要角色，但調(diào)控方式仍存在爭議，需要進一步的研究證實。因此，我們首先檢測了豬原代成肌細胞分化過程中FoxO1的表達情況。結(jié)果顯示，在豬成肌細胞的分化過程中，F(xiàn)oxO1基因的表達量顯著上調(diào)，而總蛋白表達量變化并不顯著，其磷酸化水平呈現(xiàn)上升趨勢，表明FoxO1的失活狀態(tài)對于成肌細胞的分化是非常必要的。

依照本實驗室已建立的方法[4]，培養(yǎng)豬原代骨骼肌成肌細胞。原代細胞以0.5×106個/cm2密度接種至六孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于 5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)基，此后每隔2 d換液1次。當細胞匯合至60%~70%時，將含15%胎牛血清的培養(yǎng)液換成 2%馬血清的培養(yǎng)基誘導分化，持續(xù)培養(yǎng)5 d，收集細胞進行后續(xù)檢測。

[3] Van Der Heide LP, Hoekman MF, Smidt MP. The ins and outs of FoxO shuttling: mechanisms of FoxO translocation and transcriptional regulation. Biochem J, 2004, 380(Pt 2): 297?309.

1.2.2 脂質(zhì)體介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬原代成肌細胞

原代豬骨骼肌成肌細胞在含15%胎牛血清和抗生素的 DMEM/F-12培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞轉(zhuǎn)入六孔板，加入含15%小牛血清而無抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞匯合至 60%~70%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按說明書進行，先將4 μg的質(zhì)粒DNA稀釋于250 μL培養(yǎng)基中，再將10 μL的Lipofectamine 2000稀釋于250 μL培養(yǎng)基中，5 min后將二者混合，混勻后室溫放置20 min。更換待轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基為Opti-MEM (Invitrogen) 培養(yǎng)基，加入DNA和Lipofectamine 2000的混合物，培養(yǎng)5 h后更換為含15%胎牛血清無抗生素的培養(yǎng)基。為了獲得穩(wěn)定表達目的基因的細胞株，在培養(yǎng)基中添加200 μg/mL的G418，繼續(xù)培養(yǎng)7~14 d，篩選具有G418抗性的細胞。最后用Western blotting篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞。

超前網(wǎng)絡化：①對照月度作業(yè)計劃，基層隊組三日內(nèi)超前制定網(wǎng)絡工期表；②各專業(yè)科室對照網(wǎng)絡，詳細列出當月超前管理的變化環(huán)節(jié)，進行跟蹤落實；③突出對超前探測地質(zhì)變化，準確掌握構(gòu)造位置、類型、產(chǎn)狀等信息，制定相關安全技術措施，跟蹤落實。

1.2.3 引物設計

根據(jù) GenBank已發(fā)表的基因序列 (FoxO1、MyoD、Myogenin、β-actin 的GenBank 登錄號分別為：NM_214014.2，NM_001002824，NM_001012406，NM_007393)，嚴格按照實時定量引物設計原則，應用Primer Premier 5.0軟件，設計引物進行目的基因擴增。引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for genes

1.2.4 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

按照RNAiso Plus (TaKaRa) 總RNA提取試劑說明書提取誘導分化第 0、3、5天的豬原代成肌細胞的總 RNA，用 DNaseⅠ處理后，1%瓊脂糖凝膠檢測RNA的完整性并用Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量儀對 RNA定量，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.5 實時熒光定量PCR

“兩線合一”的劃定是一個集自然、社會與經(jīng)濟的符合生態(tài)系統(tǒng)，本文以生態(tài)控制的視角，將城市開發(fā)邊界與生態(tài)安全關聯(lián)起來，結(jié)合以往城市“兩線合一”的劃定經(jīng)驗，將其分類研究，探索“兩線合一”的劃線模式，并以北京城市副中心的“兩線合一”劃定為例，提出“守住底線，總量控制，留有余地”的生態(tài)控制型城市開發(fā)邊界與生態(tài)紅線“兩線合一”的劃線方法。

利用Smart Cycler II (Cepheid公司) 實時PCR系統(tǒng)進行實時定量擴增。反應總體系25 μL，其中：滅菌的ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物 (10 μmol/L) 1 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×) 12.5 μL。采用兩步法PCR反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共45個循環(huán)?；虻南鄬Ρ磉_采用2?ΔΔCt公式計算。

改革和完善農(nóng)村社會保障制度，既是維護最廣大農(nóng)民群眾的根本利益的必然要求，也是我國實現(xiàn)全面建設小康社會目標的重要路徑，對于實現(xiàn)城鄉(xiāng)統(tǒng)籌，社會和諧具有極大的重要意義。因此，基于我國當前農(nóng)村公共產(chǎn)品供給現(xiàn)狀，結(jié)合當前經(jīng)濟社會實際情況，就完善社會保障制度的建設，從三個方面提出以下一些建議與思考：

1.2.6 Western blotting

伊德里斯的地圖中雅朱者和馬朱者出現(xiàn)在中國北方(見圖3)，在“亞歷山大邊墻”后面有一塊銘文，寫著“屬于包圍雅朱者和馬朱者的庫法亞(Kufaya)山脈”。邊墻有門，大門處標識了亞歷山大的阿拉伯名字杜爾-卡奈因(Dul-Karnai)。

HCY是蛋氨酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，是含硫的氨基酸。有研究發(fā)現(xiàn)，HCY在代謝過程中損傷血管內(nèi)皮細胞，是心腦血管疾病的獨立危險因子之一[6-7]；致病機制是由于HCY是中間代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)的不穩(wěn)定性，易產(chǎn)生過氧化物和氧自由基，啟動低密度脂蛋白的過氧化反應，導致腎組織細胞的損害和凋亡，從而加速病情的進展；HCY能促進動脈平滑肌細胞增生并加快動脈粥樣硬化斑塊形成；同時HCY通過激活凝血因子和促進血小板聚集來啟動凝血功能，降低纖溶活性，從而使增加血栓形成概率。該研究結(jié)果顯示，血清HCY的表達水平與ACR呈正相關，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），監(jiān)測HCY水平有助于判斷DN的發(fā)生發(fā)展。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS洗1遍，每皿加入 200 μL的細胞裂解液。當細胞充分裂解后，12 000×g離心5 min，取上清，以BradFord方法對總蛋白質(zhì)進行定量。提取的總蛋白95℃加熱10 min，10% SDS-PAGE分離蛋白，接著以200 mA的電流將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，用抗FoxO1、P-FoxO1 (Ser256)、MyoD、myogenin、β-actin和 FLAG的抗體 (1∶200)，4℃孵育過夜。再與對應的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗 (1∶2 000)室溫下孵育2 h，最后利用Bio-Rad GS-800曝光系統(tǒng)檢測目的蛋白，并用Quantity One軟件分析蛋白表達量。

采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件One-way ANOVA進行方差分析與顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬原代成肌細胞的分化

豬原代成肌細胞培養(yǎng)48 h后，貼壁，形態(tài)呈長梭形 (圖1A)。2%馬血清誘導分化3 d后，成肌細胞變得細長，開始融合 (圖1B)。誘導分化5 d后，可以看到有肌管形成 (圖1C)。

2.2 豬原代成肌細胞分化過程中 FoxO1的表達變化

檢測原代豬成肌細胞FoxO1在分化0、3、5 d表達的變化。實時定量 RT-PCR結(jié)果表明，在豬成肌細胞分化過程中，F(xiàn)oxO1 mRNA表達顯著上調(diào)(圖2A)。然而，Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此過程中FoxO1總蛋白的表達量沒有顯著變化，但其磷酸化水平顯著增加 (圖2B?D)。

羅恬隱隱覺得有些不安，趙炎始終沒有消息，公司里也沒人知道他去了哪里，電話也打不通。更讓羅恬不安的是，她總覺得這幢大房子里，還藏著另一個人。有時她會聽到一樓傳來沉悶的腳步聲。有時會聽到閣樓里“咔咔”的機械聲，那些莫名響起的聲音，在寂靜的深夜里聽起來格外詭異。

2.3 FoxO1質(zhì)粒成功感染豬原代成肌細胞的鑒定

原代豬成肌細胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 pcDNA3和pcDNA3- FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒72 h后，提取細胞蛋白進行Western blotting，檢測FoxO1蛋白表達情況。如圖3所示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒的豬成肌細胞中FoxO1表達顯著提高，同時也可檢測到FLAG標簽的表達。

由此，最終確定以下6個企業(yè)協(xié)調(diào)聯(lián)動的關鍵影響因素：相互依賴與信任(IT)、不確定性(UC)、企業(yè)文化(EC)、信息溝通與共享(ICS)、利益分享(BS)、政策法律環(huán)境(PLE)。各因素對企業(yè)之間協(xié)調(diào)聯(lián)動機制實施效果的影響最終通過戰(zhàn)略目標(SO)和協(xié)調(diào)績效(CP)指標來反映。

圖1 豬原代成肌細胞體外培養(yǎng)及誘導分化形態(tài)圖Fig. 1 Differentiation and morphometric analysis of pig skeletal muscle myoblast differentiation at 0 day (A), 3 day (B) and 5 day (C).

圖2 豬原代成肌細胞分化過程中FoxO1的表達變化Fig. 2 FoxO1 expression pattern during pig myoblast differentiation. Real-time PCR (A) and Western blotting (B) were performed to quantify the the time-course expression of FoxO1 during myoblast differentiation. (C?D) Densitometric analysis of total FoxO1and FoxO1 phospholation normalized against β-actin, respectively. *P<0.05.

圖3 質(zhì)粒成功導入豬成肌細胞的鑒定Fig. 3 Identification of plasmids transfected into porcine myoblasts successfully by Western blotting.

2.4 FoxO1過表達對豬原代成肌細胞分化的影響

對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3和pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒的豬成肌細胞進行分化誘導，觀察誘導分化第5天時細胞的形態(tài)學變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組空質(zhì)粒在誘導5 d后，細胞正常分化，并有肌管形成 (圖4B)。然而，過表達 FoxO1的豬成肌細胞雖也進行分化并呈現(xiàn)梭形生長，但成肌分化進程被明顯推遲，未能形成肌纖維 (圖4D)。

2.5 FoxO1過表達對豬原代成肌細胞分化標志基因的影響

圖4 高表達FoxO1推遲豬成肌細胞的分化進程Fig. 4 Over-expression of FoxO1 delayed pig myoblast terminal differentiation. Differentiation and morphometric analysis of pig skeletal muscle myoblast differentiation at 0 day and 5 day in control (A and B) and FoxO1-infected cells (C and D), respectively.

對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3和pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒的豬成肌細胞進行分化誘導，分別檢測誘導分化第3天 (D3) 和第5天 (D5) 時，成肌分化早期標志基因MyoD和晚期標志myogenin的表達變化。如圖5A所示，對照組細胞中MyoD在成肌細胞早期表達，分化第 3天達到峰值，分化末期 (D5) 表達量回到基礎水平。成肌分化晚期標志myogenin隨著分化時間的推移逐漸升高 (圖 5C)。高表達FoxO1的豬成肌細胞中，MyoD 和myogenin mRNA含量均顯著降低 (P＜0.05) (圖 5A、5C)。Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達FoxO1的豬成肌細胞中MyoD蛋白表達量略有下降，但差異并不顯著，而 myogenin蛋白表達量與轉(zhuǎn)錄水平保持一致，受到顯著抑制 (圖5B、5D、5E)。

3 討論

After adding metamaterial to the design of simple patch， the structure will be as below:

“地者，政之本也！”土地資源是農(nóng)民賴以生存的物質(zhì)保證，是生活生產(chǎn)中不可或缺的重要組成部分，土地政策更是盤活土地資源，帶領農(nóng)民脫貧致富的保證，是精準扶貧工作穩(wěn)步前行，各項政策落地的物質(zhì)保障。做好土地政策研究、制定與落實，是盤活土地資源，釋放土地價值，助推其他精準扶貧政策有效實施的基礎性工作。

圖5 高表達FoxO1對豬成肌細胞分化標志基因的影響Fig. 5 Over-expression of FoxO1 inhibited pig myoblast terminal differentiation. Real-time PCR (A and C) and Western blotting (B and D) showed the changes of early and late myogenic factors (MyoD and myogenin) in control and FoxO1-infected cells. (E) Densitometric analysis of MyoD and myogenin at 5 days differetiation (D5) normalized against β-actin. *P<0.05.

MyoD 和 myogenin屬于生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenic regulation factors，MRFs)，可激活肌肉的基因轉(zhuǎn)錄，抑制肌細胞增殖，促進分化，在骨骼肌發(fā)生早期起到重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]。本實驗室楊燕軍等[14]通過對不同品種豬背最長肌的組織差異分析發(fā)現(xiàn)FoxO1和MyoD基因的表達在肌肉發(fā)育中存在負相關 (P＜0.05)。為了進一步證明 FoxO1在成肌分化中的作用，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達FoxO1的豬原代成肌細胞株，并檢測了早期和晚期成肌標志分子MyoD和myogenin的表達情況。與對照組成肌細胞相比，過表達 FoxO1的豬成肌細胞中，MyoD和myogenin基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量受到顯著抑制(P＜0.05)。同時，Western blotting結(jié)果顯示早期成肌標志 MyoD蛋白表達量雖受到抑制但變化不明顯，然而晚期標志myogenin蛋白表達與其基因表達保持一致，顯著下調(diào) (P＜0.05)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1可以通過抑制早期標志基因MyoD推遲成肌細胞的分化，并進一步通過抑制肌肉形成的晚期標志分子myogenin阻遏肌肉的分化。

同時，生肌調(diào)節(jié)因子不僅在成肌分化中發(fā)揮重要作用，由于其調(diào)控收縮蛋白和調(diào)節(jié)蛋白同工型在不同時期表達，也可以促使肌肉細胞向不同類型的肌纖維分化[15-16]。已有研究證實，MyoD在快肌纖維中優(yōu)先表達，而myogenin在慢肌纖維中表達較多[17]。骨骼肌特異的FoxO1轉(zhuǎn)基因小鼠中，慢肌纖維數(shù)量明顯減少而快肌纖維數(shù)量沒有明顯改變[11]。然而小鼠骨骼肌中特異性地敲除FoxO1可以改變原有的肌纖維類型組成，快肌纖維含量上調(diào)并伴隨慢肌纖維的減少，同時檢測到MyoD基因表達量的增加[18]。本實驗所得結(jié)果與這些研究一致，表明FoxO1在控制肌纖維分型中也發(fā)揮重要作用，并提示FoxO1可能通過調(diào)節(jié)生肌調(diào)節(jié)因子控制肌纖維類型的分化。然而，對于FoxO1調(diào)控肌纖維類型特異性分化的具體機制還有待深入研究。

綜上所述，本研究表明FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在豬原代成肌細胞分化中發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，能夠推遲并抑制豬成肌細胞的分化，并可能參與調(diào)控骨骼肌纖維類型的終末分化。

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余傳偉的水彩畫有一種別樣的氣息。讀他的畫就如同吟一首民國時期的抒情敘事小詩，感動便不經(jīng)意的在心里流淌了，自然、隨性，并隱約有故事。

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如前所屬，本次改造工程只有廠區(qū)西側(cè)的細長地塊和東側(cè)廠前區(qū)少量預留用地可作為深度處理設施用地，綜合比較，我們選擇占地面積最小、工藝流程最簡單、運行費用較低、運行管理簡單的濾布濾池方案作為本工程過濾方案。

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