微生物木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的代謝工程

張穎，馬瑞強(qiáng),2，洪浩舟，張維，陳明，陸偉

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193

地球上的化石能源儲(chǔ)量正在以驚人的速度減少，20世紀(jì)消耗的全部能源幾乎等于前 19個(gè)世紀(jì)所消耗的能源的一半，在人類(lèi)目前的能源消耗結(jié)構(gòu)中化石類(lèi)能源占了大約 85%的份額[1]。根據(jù)全球最大的能源公司 (BP) 2009年的統(tǒng)計(jì)，按當(dāng)前經(jīng)濟(jì)發(fā)展速度對(duì)能源需求進(jìn)行估算，目前地球上已探明的可供開(kāi)采的石油、煤和天然氣將分別在 42年、122年和60.4年內(nèi)耗盡。因此開(kāi)發(fā)新的能源就顯得刻不容緩。

傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)以玉米、小麥和木薯等高淀粉植物為原料，但是隨著對(duì)乙醇需求量的增大，勢(shì)必造成燃料與人爭(zhēng)糧的局面。地球上每年通過(guò)光合作用固定到植物的碳達(dá)2×1011t，相當(dāng)于全世界每年耗能量的10倍。這些植物纖維原料主要由各種單糖通過(guò)糖苷鍵以不同的方式構(gòu)成，其中葡萄糖和木糖是主要的組成成分。利用酸解或酶解的方法將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為還原性糖會(huì)產(chǎn)生大量的五碳糖 (D-木糖和 L-阿拉伯糖) 和六碳糖 (葡萄糖、半乳糖和甘露糖)，其中六碳糖約占2/3，五碳糖約占1/3。而在半纖維素的水解產(chǎn)物中，D-木糖約占90%。由于產(chǎn)乙醇微生物不能有效地利用木糖，因此，乙醇的生產(chǎn)效率低，生產(chǎn)成本高[2]。研究表明充分利用纖維素原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，能使乙醇的產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上增加25%[3-4]。因此，高效利用木糖是利用植物纖維資源生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵之一。微生物利用木糖發(fā)酵乙醇的研究已開(kāi)展30多年，本文就這方面的研究進(jìn)行概述。

1 利用木糖產(chǎn)乙醇的微生物

迄今為止已發(fā)現(xiàn) 100多種能代謝木糖的微生物，包括細(xì)菌、真菌和酵母。Kurtzman等[5]1982年首次分離到能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的酵母嗜鞣管囊酵母Pachysolen tannophilus，由于酵母菌發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能力較其他微生物強(qiáng)，而引起了人們的關(guān)注。此后又分離到多種可發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的酵母菌株，如：樹(shù)干畢赤酵母Pichia stipitis、休哈塔假絲酵母Candida shehatae、酒香酵母Brettanomyces naardenensis、纖細(xì)假絲酵母 Candida tenuis和賽溝畢赤酵母 Pichia segobiensis[6]。盡管酵母可生產(chǎn)相對(duì)較多的酒精，但是，這些分離到的木糖發(fā)酵酵母產(chǎn)乙醇量和乙醇耐受性都要低于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，且需要限制性供氧，使得生產(chǎn)控制難度更大。同時(shí)，還存在對(duì)水解物中低濃度抑制物敏感、副產(chǎn)物較多等問(wèn)題。目前所發(fā)現(xiàn)的能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株，除酵母菌外，還包括細(xì)菌：多動(dòng)擬桿菌Bacteroides polypragmatus、菊歐文氏桿菌Erwinia chrysanthem、植物克雷伯桿菌Klebsiella planticola、嗜熱厭氧乙醇菌 Thermoanaerobacter ethanolicus、球狀螺旋體Spirochaeta coccoides sp.、植物發(fā)酵梭菌Clostridium phytofermentas sp.；真菌：尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum、粗糙脈孢菌Neurospora crassa和燕麥鐮刀菌Fusarium avenaceum等。但這些菌株利用木糖轉(zhuǎn)化乙醇的效率比葡萄糖等已糖發(fā)酵效率低，發(fā)酵速率慢并產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，難以應(yīng)用于乙醇工業(yè)生產(chǎn)。

木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇研究主要集中在大腸桿菌、酵母菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌上。大腸桿菌底物廣泛，所需營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，但是厭氧條件木糖發(fā)酵乙醇產(chǎn)量低；釀酒酵母乙醇耐受性高，對(duì)纖維素水解液中抑制物的抗性高，但是缺乏將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖所需的酶；運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠耐受低 pH環(huán)境，高濃度葡萄糖以及高乙醇濃度，是唯一厭氧條件下通過(guò) ED途徑發(fā)酵葡萄糖的微生物，但它卻不能利用五碳糖。上述 3類(lèi)微生物在木糖利用上均存在缺陷，難以應(yīng)用于乙醇工業(yè)生產(chǎn)，因此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多年來(lái)人們一直致力于不斷地利用遺傳工程改造上述微生物，以期獲得適于大規(guī)模乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的菌株 (表1)。

表1 木糖代謝遺傳工程菌研究Table 1 The studies of engineering microorganism for xylose metabolism

續(xù)表1

2 木糖代謝途徑

微生物是通過(guò)木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的代謝途徑而利用木糖。在一些細(xì)菌和低等真菌中木糖通過(guò)木糖異構(gòu)酶 (Xylose isomerase，XI) (EC 5.3.1.5) 催化后轉(zhuǎn)化為木酮糖；而在一些酵母和絲狀真菌中，木糖經(jīng)木糖還原酶 (Xylose reductase，XR) (EC 1.1.1.21) 催化生成木糖醇，然后由木糖醇脫氫酶(Xylitol dehydrogenase，XDH) (EC 1.1.1.9) 作用生成木酮糖，XR和XDH分別需要NADPH和NAD+作為輔酶。木酮糖經(jīng)過(guò)木酮糖激酶 (Xylulokinase，XK)磷酸化生成 5-磷酸木酮糖，進(jìn)入磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway，PPP)。磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖以及3-磷酸甘油醛通過(guò)酵解途徑形成糖代謝的中心產(chǎn)物丙酮酸，丙酮酸在缺氧條件下被丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶脫羧還原為乙醇。最近在新月柄桿菌Caulobacter crescentus中又發(fā)現(xiàn)了新的木糖代謝途徑[30]，即 NAD依賴(lài)的木糖脫氫酶 (XDH) 途徑。該途徑從D-xylose經(jīng)木糖脫氫酶 (xylB) 脫氫生成 D-xylonolactone，再經(jīng)xylonolactonase (xylC) 反應(yīng)生成D-xylonate，再經(jīng)過(guò)脫水酶 (xylD) 脫水后生成 2-酮-3-脫氧戊酸，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步脫水及脫氫反應(yīng)，最后生成 α-酮戊二酸，進(jìn)入TCA循環(huán) (圖1)。

圖1 木糖的主要代謝途徑Fig. 1 Main metabolic pathway of xylose.

3 利用木糖產(chǎn)乙醇酵母的代謝工程

隨著利用木糖微生物的分離以及木糖代謝途徑研究的深入和分子生物學(xué)的發(fā)展。利用代謝工程研究和開(kāi)發(fā)能高效代謝各種糖源的產(chǎn)乙醇重組菌成為全球關(guān)注的重點(diǎn)。主要包括兩個(gè)方面：1) 引入五碳糖代謝途徑到高效產(chǎn)乙醇菌中，如釀酒酵母S. cerevisiae、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis，擴(kuò)大底物利用范圍；2) 將高效產(chǎn)乙醇基因?qū)刖哂械孜锢梅秶鷱V的微生物中如大腸桿菌 Escherichia coli，提高乙醇轉(zhuǎn)化率。

3.1 釀酒酵母木糖發(fā)酵乙醇途徑的改造

釀酒酵母是工業(yè)上生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌株，與細(xì)菌相比具有較高的乙醇耐受濃度，對(duì)纖維素水解液中的抑制物有較高的抗性。但是，酵母菌不能利用木糖，Kotter等[31]、Amore等[32]在釀酒酵母中表達(dá)樹(shù)干畢赤氏酵母的木糖還原酶基因 (XYL1) 與木糖醇脫氫酶基因 (XYL2)，其酵母轉(zhuǎn)化子在有氧條件下能利用木糖生成木酮糖。但是，木糖還原酶對(duì) NADPH的親和能力比對(duì)NADH高，木糖醇脫氫酶僅利用NAD+，使得輔酶代謝不平衡，導(dǎo)致重組釀酒酵母發(fā)酵木糖過(guò)程中木酮糖累積、細(xì)胞生長(zhǎng)和木糖發(fā)酵速率下降。

為了提高重組釀酒酵母利用木糖產(chǎn)生乙醇的轉(zhuǎn)化效率，Watanabe等[26]將點(diǎn)突變的畢赤氏酵母木糖還原酶 (K270R替換的PsXR) 和其野生型木糖醇脫氫酶 (PsXDH) 基因，轉(zhuǎn)入到 S. cerevisiae，由于K270R PsXR降低了NADPH親和能力，使得重組S. cerevisiae的乙醇產(chǎn)量增加了4l%，降低了木糖醇產(chǎn)量的積累 (下降86%)。Almeida等[33]證實(shí)，表達(dá)P. stipitis的XR的重組S. cerevisiae菌，不但能利用木糖，還能還原糠醛化合物，減輕其毒害作用，從而能夠利用羥甲基糠醛含量高的木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。另外， Petschacher等[27]構(gòu)建了利用S. cerevisiae強(qiáng)啟動(dòng)子TDH3表達(dá)C. tenuis的木糖還原酶 (XR) 或 K274R-N276D 雙突變體酶和Galactocandida mastotermitis的木糖醇脫氫酶(XDH) 基因的操縱子，整合到S. cerevisiae的基因組中，重組菌厭氧發(fā)酵木糖 (20 g/L) 結(jié)果表明，含K274R-N276D雙突變體 CtXR工程菌較含野生型CtXR工程菌乙醇產(chǎn)量增加42% (0.34 g/g)，木糖醇和甘油的產(chǎn)量分別降低了 52%和 57%。Karhumaa等[34]利用P. stipitis的XR、XDH和Piromyces sp.的XI編碼基因，導(dǎo)入S. cerevisiae中，分別構(gòu)建了重組菌株TMB3057和TMB3066，木糖發(fā)酵試驗(yàn)顯示TMB3057在100 h內(nèi)消耗木糖39.6 g/L，每克木糖產(chǎn)生0.33 g乙醇；TMB3066菌株100 h內(nèi)消耗木糖16.8 g/L，每克木糖產(chǎn)生0.43 g乙醇。

由于細(xì)菌木糖異構(gòu)酶催化D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖過(guò)程中不需要輔酶，不會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)還原力的不平衡[35]。Lonn等[36]將嗜熱細(xì)菌 Thermus thermophilus的木糖異構(gòu)酶基因 xylA導(dǎo)入釀酒酵母 S. cerevisiae中，并定向進(jìn)化篩選獲得K274R和N276D替換的木糖異構(gòu)酶，能在酵母適宜生長(zhǎng)溫度條件下穩(wěn)定表達(dá)，其酶活提高到原來(lái)的9倍。沈煜等[25]將來(lái)自嗜熱細(xì)菌T. thermophilus的xylA基因和釀酒酵母自身的xks1基因插入釀酒酵母工業(yè)菌株 NAN-227的染色體中，其重組菌的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶活性均高于出發(fā)菌株；木糖、葡萄糖共發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示木糖利用率和乙醇產(chǎn)率比出發(fā)菌株分別提高了43.8%和9.5%。

3.2 木糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的改造

釀酒酵母的木糖吸收主要是通過(guò)高親和力葡萄糖運(yùn)輸因子HXT4、HXT5、HXT7和Gal2介導(dǎo)的，其木糖的跨膜運(yùn)輸受葡萄糖的強(qiáng)烈抑制[37]。Leandro[38]將中間假絲酵母Candida intermedia編碼葡萄糖/木糖同向轉(zhuǎn)移因子的基因?qū)氲结劸平湍?，有效提高木糖的跨膜運(yùn)輸 (其表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的Km值是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖 Km值的 1/10)。Saloheimo等[39]采用缺失 7個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子基因的酵母突變株為宿主菌，從高效代謝戊糖的絲狀真菌 Trichoderma reesei的cDNA文庫(kù)中，篩選到hxt1、hxt2、hxt4、hxt7和trxlt1的五碳糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子基因，這些基因的表達(dá)促進(jìn)了重組酵母對(duì)木糖的利用。在酵母中過(guò)量表達(dá)真菌 Orpinomyces木糖異構(gòu)酶基因，畢赤酵母糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (SUT1) 基因和自身的木酮糖激酶基因，促進(jìn)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和乙醇的生成[40]。

4 利用木糖的產(chǎn)乙醇細(xì)菌的代謝工程

4.1 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用木糖的乙醇代謝工程

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Z. mobilis是唯一利用ED途徑厭氧生產(chǎn)乙醇的微生物，具有高效轉(zhuǎn)化己糖為乙醇的酶系統(tǒng)。但Z. mobilis底物利用范圍極窄，不能利用五碳糖。目前已有兩株Z. mobilis菌的全基因組序列公布[41-42]。1995年，Zhang等[29]通過(guò)代謝工程，將E. coli的xylA (木糖異構(gòu)酶基因)、xylB (木酮糖激酶基因)、talB (轉(zhuǎn)酮醇酶基因)、tktA (轉(zhuǎn)醛醇酶基因)導(dǎo)入到Z. mobilis中。使Z. mobilis獲得利用木糖的能力，其乙醇產(chǎn)率為0.44 g/(g·h)，達(dá)到理論值的84%。Zhang等[43]在2003年又將含有上述木糖代謝途徑的基因整合到位于染色體上的乳酸脫氫酶基因 (ldh)中，減少了重組菌中乳酸的形成，增加了細(xì)胞的生長(zhǎng)，其乙醇產(chǎn)率與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組菌相當(dāng)。同時(shí)，在無(wú)選擇壓力的情況下保持了外源基因的遺傳穩(wěn)定性。本研究室將大腸桿菌木糖代謝的關(guān)鍵酶基因，引入到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，混合糖發(fā)酵過(guò)程中，重組菌利用葡萄糖和木糖生成乙醇的效率分別達(dá)到理論值的81.2%和63.1%[44]。

另外Thompsan等將Z. mobilis的丙酮酸脫羧酶(pdc) 基因轉(zhuǎn)入熱葡糖苷酶地芽孢桿菌 Geobacillus thermoglucosidasius中，在 52℃條件下仍然可以表達(dá)出有活性的PDC，為高溫發(fā)酵產(chǎn)乙醇探索了新菌株和新途徑[45]。

4.2 大腸桿菌的發(fā)酵乙醇代謝工程

大腸桿菌E. coli是目前基因工程中研究最廣泛和最深入的模式菌株，其底物利用范圍廣，包括植物生物量中的幾乎所有糖類(lèi)。Ingram等[46]首次將含有PET操縱子 (攜帶運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫氫酶和乙醇脫氫酶基因) 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli菌株，使重組E. coli的已糖和戊糖代謝形成的中心代謝物——丙酮酸轉(zhuǎn)向乙醇生產(chǎn)；重組大腸桿菌每克木糖發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量高于已報(bào)道的釀造酵母每克葡萄糖發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量。12%葡萄糖、12%乳糖、8%木糖發(fā)酵分別能產(chǎn)生7.2%、6.5%、5.2%的乙醇 (V/V)[8]。Ohta等[13]將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因整合到位于染色體上的丙酮酸甲酸裂解酶基因 (pfl) 中，并敲除丙酮酸-甲酸裂解代謝支路。構(gòu)建的重組菌KO11具有較好的遺傳穩(wěn)定性，Yomano等[47]通過(guò)不斷增加乙醇濃度對(duì)KO11定向進(jìn)化，獲得耐乙醇突變株LY01，突變株發(fā)酵木糖 (140 g/L) 產(chǎn)生的乙醇達(dá)理論值的 88.5%，高于親本菌 KO11 (83.3%)。Gonzalez等[48]對(duì)耐乙醇突變株LY01和親本菌KO11在乙醇脅迫下的全基因表達(dá)圖譜分析的結(jié)果顯示，LY01增加滲透保護(hù)物的代謝(氨基乙酸的降解和甜菜堿合成和吸收)，增強(qiáng)了對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中抑制物的耐受能力。Hespell等[9]、Dien等[49]采用缺失乳酸脫氫酶 (ldh) 和丙酮酸甲酸裂解酶 (pfl) 的大腸桿菌為出發(fā)菌株，構(gòu)建含 pet操縱子質(zhì)粒的重組菌(FBR1、FBR2和FBR5)，由于缺失ldh和pfl后，細(xì)胞不能厭氧生長(zhǎng)，導(dǎo)入的質(zhì)粒能恢復(fù)細(xì)胞厭氧生長(zhǎng)，使得重組菌高表達(dá)產(chǎn)乙醇基因，同時(shí)在厭氧條件下質(zhì)粒不丟失。在發(fā)酵過(guò)程中，含有pdc和adhB基因質(zhì)粒的重組菌在無(wú)添加抗生素時(shí)維持遺傳穩(wěn)定和高乙醇產(chǎn)率。乙醇產(chǎn)量最好的菌株為FBR5，能利用玉米芯水解產(chǎn)物，發(fā)酵每克糖產(chǎn)生0.46~0.51 g乙醇，達(dá)理論產(chǎn)值的90%以上。利用大腸桿菌ΔldhA ΔpflB突變株，Kim等[18]通過(guò)化學(xué)誘變方法，使自身的乙醇代謝途徑發(fā)生突變，獲得一株能在厭氧條件下生長(zhǎng)的產(chǎn)乙醇菌株SE2378。突變位點(diǎn)在pdh操縱子內(nèi)，使得通常只在有氧條件下才有活性的丙酮酸脫氫酶在厭氧條件下參與了乙醇發(fā)酵，突變株發(fā)酵木糖的產(chǎn)量達(dá)到2.24 g/(h·g cells)，無(wú)論是發(fā)酵產(chǎn)量還是發(fā)酵速率都高于葡萄糖發(fā)酵。

近來(lái)，Trinh等[19]提出一種具有最基本細(xì)胞功能生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化器的策略，為獲得高效產(chǎn)乙醇重組菌，從大腸桿菌中15 000條可能的途徑中挑選出了6條代謝途徑，進(jìn)行中心代謝路徑的改造。構(gòu)建了Δzwf、Δndh、ΔsfcA、ΔmaeB、ΔldhA、ΔfrdA、ΔpoxB、Δpta::Km 缺失突變株 TCS083。導(dǎo)入pLOI297的TCS083重組菌發(fā)酵80 g/L葡萄糖產(chǎn)生38.77 g/L乙醇，與通過(guò)模型計(jì)算的39.20 g/L極其接近，高于 MG1655/pLOI297的最終乙醇產(chǎn)量(36.53 g/L)。其乙醇轉(zhuǎn)化率比KO11、FBR5/pLOI297菌株高出6%，達(dá)到了96%。

5 展望

利用豐富、廉價(jià)的木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇是乙醇工業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)。工業(yè)生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌種釀酒酵母主要以淀粉為原料，不能發(fā)酵木糖；而具有將己糖高效轉(zhuǎn)化成乙醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌底物利用范圍窄，使其應(yīng)用受到極大的限制；大腸桿菌能利用木糖，但是乙醇的發(fā)酵效率低，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)出能有效利用各種糖類(lèi)高效生產(chǎn)乙醇的微生物菌種。盡管對(duì)各種微生物進(jìn)行乙醇發(fā)酵代謝工程改造，能有效地?cái)U(kuò)大菌株的底物利用范圍、提高乙醇產(chǎn)率等，但仍存在著不少問(wèn)題，比如產(chǎn)乙醇菌株的遺傳穩(wěn)定性、代謝工程優(yōu)化代謝體系過(guò)程中最大限度地減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，增強(qiáng)乙醇代謝酶的表達(dá)及活性，因改變細(xì)胞代謝流而引起的代謝平衡喪失、細(xì)胞生長(zhǎng)減緩等。另外，通過(guò)基因工程等技術(shù)選育耐高溫、耐高乙醇和耐高滲能力的產(chǎn)乙醇微生物和重組菌是縮短發(fā)酵周期和提高乙醇產(chǎn)量、降低成本的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。因此，這方面的研究將成為未來(lái)研發(fā)的重點(diǎn)。

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