沙眼的實驗室檢查方法進展

劉蘋蘋,楊穎秋,李 勤

(中山大學附屬第五醫(yī)院,廣東珠海519000)

沙眼(trachoma)是由沙眼衣原體(chlamydia trachomatis)引起的一種慢性傳染性結膜角膜炎。因其在瞼結膜面表現(xiàn)形成粗糙不平的外觀,形似沙粒,故名沙眼。本病早期結膜有乳頭增生,濾泡形成,角膜血管翳,晚期眼瞼結膜發(fā)生瘢痕,致使眼瞼內翻畸形,加重角膜損傷,嚴重影響視力,是導致可預防性失明的主要原因。

1 病原體及發(fā)病機制

1.1 病原體

沙眼是由沙眼衣原體所引起的特異性感染。沙眼衣原體屬于衣原體的一種。衣原體是一種嚴格寄生在細胞內,有獨特的發(fā)育周期,能通過細菌濾器的原核細胞微生物。根據其所致疾病和某些生物學性狀不同可分為沙眼生物亞種(Biovar trachoma),性病淋巴肉芽腫亞種(Biovar lymphogranuloma venereum,LGV)和鼠亞種(Biovar mouse)。沙眼生物亞種眼型有A、B 、Ba、C 血清型 ,眼生殖泌尿型有 D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K10 個血清型 。淋巴肉芽腫亞種有L1、L2、L2a、L3 4個血清型 。沙眼衣原體A 、B、Ba、C 血清型主要致沙眼,也可導致泌尿生殖道感染。D-K血清型主要引起泌尿生殖道感染及多種并發(fā)癥,如尿道炎、前列腺炎、膀胱炎、睪丸炎、附睪炎、宮頸炎、子宮內膜炎、盆腔炎、輸卵管炎、輸卵管閉鎖、異位妊娠及肝周炎等,并成為男、女性不孕癥的重要病因,此外也可導致沙眼、游泳池結膜炎、新生兒圍產期感染(如包涵體結膜炎、肺炎、中耳炎等)。

沙眼衣原體呈球形或橢圓形,直徑為0.2-0.4 μ m。Giemsa染色呈紫紅色;Macchiavello染色呈紅色,在光學顯微鏡下可以看見。衣原體對熱抵抗力較弱,在60℃僅能存活5-10 min;對低溫抵抗力強,在-70℃可存活數年,凍干可保存30年以上。70%乙醇0.5 min或2%的來蘇5 min均可殺死衣原體。衣原體對大環(huán)內酯類和四環(huán)素類抗生素敏感。

1.2 發(fā)病機制

沙眼衣原體感染宿主后,通過其表面結構吸附至敏感的結膜、角膜上皮細胞上,肝硫素在此起著“橋梁”作用,但細胞表面受體和沙眼衣原體的具體作用尚不完全了解。沙眼衣原體在宿主細胞內生長、增殖時,具有一種特殊的兩相生活周期。即具有感染性、發(fā)育成熟的原體期和無感染性、發(fā)育幼稚的始體或網狀體期[1]。沙眼衣原體被膜脂多糖和外膜蛋白為衣原體型特異抗原。沙眼衣原體能產生毒素,毒素與衣原體顆粒結合在一起而不被分泌到體外。沙眼衣原體毒素有抗原性,可被免疫血清中和。機體感染沙眼衣原體后,首先反應為巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞等的浸潤,隨后發(fā)生中性粒細胞反應。樹突狀細胞表達多種細胞因子和化學趨化因子,如CCR-7,IL-12及干擾素誘導蛋白10,這些因子引導樹突狀細胞向感染部位游走,并誘導局部保護性的CD4+Th1細胞免疫反應[2]。原發(fā)感染多僅引起輕微的組織損傷,再次感染則會迅速引發(fā)嚴重的炎癥反應,加重原有的沙眼血管翳及瘢痕形成,甚至瞼板肥厚變形,引起瞼內翻倒睫,加重角膜混濁,損害視力。合并其他細菌性感染,也使病情加重。關于沙眼衣原體感染發(fā)病機制的較普遍觀點為:沙眼衣原體熱休克蛋白(c-hsp60)作為致敏原引起了宿主的自身免疫應答。在持續(xù)性感染中,細胞因子、沙眼衣原體增殖、抗體產生及變態(tài)反應的周期性變化造成了慢性炎癥和瘢痕形成。

2 臨床表現(xiàn)

有接觸史:包括家族患沙眼史、集體生活史、共同生活史。患者的工作、工作性質和工作環(huán)境。經常從事野外工作、洗手洗臉不便或者農村作業(yè)者沙眼發(fā)病率高。水源:詢問患者使用自來水還是井水。有學者認為,水源傳染是沙眼流行的重要因素。個人衛(wèi)生習慣:是否與他人公用一盆,一條毛巾及一盆洗臉水的習慣。

急性期主要表現(xiàn)為畏光、流淚、異物感,較多黏液或黏液膿性分泌物。可出現(xiàn)眼瞼紅腫,結膜明顯充血,乳頭增生,上下穹隆部結膜滿布濾泡,可合并彌漫性角膜上皮炎及耳前淋巴結腫大。

慢性期無明顯不適,僅眼癢、異物感、干燥和燒灼感。結膜充血減輕,結膜污穢肥厚,同時有乳頭及濾泡增生,病變以上穹隆及瞼板上緣結膜顯著,并可出現(xiàn)垂簾狀的角膜血管翳。病變過程中,結膜的病變逐漸為結締組織所取代,形成瘢痕。最早在上瞼結膜的瞼板下溝處,稱之為Arlt線,漸成網狀,以后全部變成白色平滑的瘢痕。角膜緣濾泡發(fā)生瘢痕化改變臨床上稱為Herbet's小凹。沙眼性角膜血管翳及瞼結膜瘢痕為沙眼的特有體征。

重復感染時,并發(fā)細菌感染時,刺激癥狀可更重,并且可出現(xiàn)視力減退。晚期發(fā)生瞼內翻與倒睫、上瞼下垂、瞼球粘連、角膜混濁、實質性結膜干燥癥、慢性淚囊炎等并發(fā)癥。導致癥狀更明顯,可嚴重影響視力,甚至失明。

3 診斷

多數沙眼根據乳頭、濾泡、上皮、上皮下角膜炎,血管翳(起自角膜緣的纖維血管膜進入透明角膜形成)、角膜緣濾泡、Herbert小凹等特異性體征,可以作出診斷[3]。由于瞼結膜的乳頭增生和濾泡形成并非為沙眼所特有,因此早期沙眼的診斷在臨床病變尚不完全具備時較困難,有時只能診斷“疑似沙眼”,要確診須輔以實驗室檢查。

世界衛(wèi)生組織(WHO)要求診斷沙眼時應至少符合下述標準中的二條:(1)上瞼結膜5個以上濾泡;(2)典型的瞼結膜瘢痕;(3)角膜緣濾泡或Herbert小凹;(4)廣泛的角膜血管翳。

1987年世界衛(wèi)生組織(WHO)介紹了一種新的簡單分期法來評價沙眼嚴重程度[4]。(1)TF:上瞼結膜5個以上濾泡;(2)TI:彌漫性浸潤、乳頭增生、血管模糊區(qū)＞50%;(3)TS:典型的瞼結膜瘢痕;(4)TT:倒睫或瞼內翻;(5)CO:角膜混濁。其中TF、TI是活動期沙眼,要給予治療,TS是患過沙眼的依據,TT有潛在致盲危險需行眼瞼矯正手術。CO是終末期沙眼。

4 實驗室檢查

沙眼衣原體(Ct)的實驗室檢測方法主要有三大類:(1)細胞生物學方法:①涂片鏡檢;②細胞分離培養(yǎng)。(2)免疫學方法:①直接免疫熒光抗體測定(DFA);②酶免疫測定(ELA);③金標法測定(DIGFA)。(3)分子生物學檢測方法:①直接檢測核酸技術(基因探針技術);②核酸擴增技術:A.靶DNA擴增;B.探針擴增;C.雜交后信號擴增。

4.1 細胞生物學方法

4.1.1 涂片鏡檢 取標本后,用碘或Giemsa染色可見寄生于柱狀上皮細胞內的包涵體。但因細胞內的包涵體脆性較大,敏感性過低,一般僅限于Ct鑒定而不用于臨床。

4.1.2 細胞分離培養(yǎng)[5]Ct專性細胞寄生,普通培養(yǎng)法不生長,只在活細胞內增殖復制。一般用Mc-Coy細胞或Hela-229細胞(或Hep-2細胞)培養(yǎng),染色后顯微鏡下觀察細胞內包涵體。特異性100%,敏感性低于100%,此法是診斷Ct感染的“金標準”,但操作復雜,技術及設備要求高,所需時間長,敏感性受標本采集、運送、保存等影響較大,且各實驗室操作步驟可不同,無標準化[6]。因而不適于臨床,多用于科研和疑難病例的終鑒定。

4.2 免疫學方法

4.2.1 直接免疫熒光抗體測定(DFA)[7]熒光標記Ct單抗與Ct結合后,原體(Ebs)在熒光顯微鏡下發(fā)熒光。針對脂多糖(LPS)的抗體熒光弱且染色不勻;針對主要外膜蛋白(MOMP)的抗體熒光亮且非特異染色少。特異性可達100%,科研中常被用作確證實驗。敏感性易受感染率的影響,熒光易淬滅,判斷結果易帶主觀性,需優(yōu)質顯微鏡及經驗豐富者操作。不適于檢測大量標本。但操作簡便、費用低。

4.2.2 酶免疫測定(EIA)用酶標記的單抗或多抗檢測Ct的LPS或MOMP,酶反應生成有色產物,用酶標儀測定。敏感性64%-98%,特異性93%-98%。在高危人群中敏感性較高,新近感染及治療監(jiān)測中敏感性明顯下降。此法簡便、操作自動化,始于短時間內大批量標本檢測。但與其它常見微生物可產生交叉反應,如金葡菌、A群及B群鏈球菌、淋病奈瑟菌、醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯菌及其他革蘭氏陰性細菌,使特異性受影響。新一代酶免疫法(ID EIA PCE Chlamydia)采用多聚酶雙重反應放大技術,敏感性高于傳統(tǒng)酶免疫法2-5倍,為91.8%,特異性為99.8%[8]。

4.2.3 斑點免疫金滲濾試驗測定(DIGFA)利用膠體金標記及膜滲濾技術,以Ct單抗作為包被抗體,快速檢測Ct。金標法雖然快捷簡便,但敏感性太低,漏檢率高,從方法學上金標試劑不存在放大效應,有多少抗原顯多少色,當抗原量低于一定水平時,就無法顯示出人肉眼可見的顏色[9]。目前臨床應用并不令人滿意,有待進一步完善。

4.3 分子生物學檢測方法

4.3.1 直接檢測核酸的技術(基因探針技術)利用核酸分子的復性原理,用特定標記探針檢測標本中的靶核酸。由最初的放射性標記逐漸發(fā)展為酶或化學發(fā)光試劑標記。其敏感性和特異性分別為73%-96%和98%-99%,無培養(yǎng)法敏感和特異,成本高,步驟繁瑣,已逐漸失去應用價值。

4.3.2 核酸擴增技術 核酸擴增技術主要有[10]:聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR),連接酶反應(ligase chain reaction,LCR),Qbeta復制酶試驗(Qβreplicase test),自動維持序列復制技術(self-sustained sequence replication,3SR),鏈置換擴增反應(strand displacement amplification,SDA),Ct基因探針轉錄介導擴增試驗(gen-probe CT transcription-mediated amplification test,TMA)等。其中PCR技術被認為將對Ct感染診斷引起革命性變化[11]。

PCR屬于一種核酸體外擴增技術,用寡核苷酸指導的DNA合成的重復循環(huán)來實現(xiàn)對靶核苷酸序列的擴增。每個循環(huán)含變性、退火、延伸3個步驟,2 h內經30個循環(huán)可將靶DNA擴增109倍。最后可用凝膠電泳或探針雜交檢測擴增的DNA。由于先將標本中的核酸特異成份擴增復制后再行檢出,其敏感性較直接檢測核酸大大提高[12]。PCR擴增的靶序列有3種:(1)主要外膜蛋白(MOMP)基因。(2)隱蔽性質粒基因。(3)rRNA基因。MOMP在每個Ct的拷貝數為1,因此擴增產物還可以用于Ct基因分型。隱蔽性質粒在 Ct中拷貝數為 10,敏感性比MOMP-PCR高。rRNA基因在Ct中含量較少,故敏感性較前兩者低。除經典PCR和PT-PCR外,有幾種特殊的PCR:(1)順序釋放酶(TETR)PCR;(2)猝滅劑標記的核酸探針(Q-DNA)PCR;(3)自動化PCR;(4)混合標本(pooling)PCR。許多研究都已表明,PCR較培養(yǎng)法和EIA法都要敏感[13],而且PCR對于有癥狀或無癥狀人群同樣敏感。

4.4 PCR技術

4.4.1 PCR的基本成分 PCR反應所需的成分主要有模版DNA,一對核苷酸引物,緩沖液,四種三磷酸脫氧核苷酸,耐熱的DNA聚合酶以及一些離子。

模版:就是需要擴增序列的核苷酸,來源很廣,幾乎所有形式的DNA和RNA都能作為PCR反應的模版。

引物:是與靶DNA的3'端和5'端特異性結合的核苷酸片段,是決定PCR特異性的關鍵。

緩沖液:要維持PCR反應的pH,必須用到緩沖液,最常用的是10-50 mmol/L的 Tris-HCL,在PCR反應中,pH值變化于6.8-7.8之間。

三磷酸脫氧核苷酸:四種三磷酸脫氧核苷酸(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)是PCR反應的原料。一般商品化供應的dNTP溶液pH為7.0,各dNTP的濃度為2.5 mmol/L,一般使用濃度控制在 20-200 μ mol/L。四種各dNTP分子濃度必須相等,以減少錯配。

耐熱DNA聚合酶:耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn),實現(xiàn)了PCR的自動化,能經受95℃以上的高溫而不失活。

其他成分:二價Mg離子能活化DNA聚合酶;DMSO有利于DNA的變性;TMAC可去除非特異擴增,促進PCR;甘油有利于DNA復性,不過并不是對所有PCR都有利。

4.4.2 PCR的基本過程 以擬擴增的DNA分子為模版,首先高溫變性,將混合物加熱到94℃維持15到30秒,使模版DNA雙鏈解旋成兩條單鏈;然后逐漸降溫退火,溫度降到55℃,使引物與模版DNA單鏈的互補序列配對結合;最后在引物、DNA聚合酶的作用下,按照半保留復制的機制沿著模版鏈延伸直至完成新的DNA合成。如此循環(huán)20次原始DNA將擴增約106。經過擴增后的DNA產物多為介于引物與原始DNA相結合的位點之間的片段。

4.4.3 熒光定量PCR技術 熒光定量PCR技術(Real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模版進行定量分析的方法。實時熒光PCR是在普通PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。它利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模版進行定量分析[14]。該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測的飛躍,而且所有反應均在同一溶液中進行,不需任何后處理過程,具有特異性更強、有效解決PCR污染的問題、自動化程度高、能實現(xiàn)多重反應、定量結果具實時性和準確性的特點[15]。

在熒光定量PCR反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著PCR反應的進行,PCR反應產物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化。從而得到一條熒光擴增曲線。熒光擴增曲線包括3個階段:基線期,擴增期和平臺期。只有在熒光信號擴增期,PCR產物量的對數值與起始模版量之間存在線性關系,所以可以在這個階段進行定量分析。為了便于對所檢測樣本進行比較,在熒光定量PCR反應的指數期,需要設定一定熒光信號的閾值,一般這個閾值是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本地信號,熒光閾值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過閾值被認為是真正的信號,它可以用于定義樣本的閾值循環(huán)數(Cycle Threshold,Ct)。每個模版的Ct值與該模版的起始拷貝數存在線性關系。在PCR過程中可以連續(xù)不斷地檢測反應體系中熒光信號的變化。當信號增強到熒光閾值時,Ct值被記錄下來。起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光定量PCR技術比起普通PCR,不用進行瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,人工分析數據等步驟。較之與以前的以終點法進行定量的PCR技術具有很大的優(yōu)勢。它操作簡便、快速高效,熒光定量PCR技術不僅具有普通PCR的高靈敏性,而且可以實時檢測PCR每個循環(huán)過程中熒光信號的變化,并獲得定量結果,具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性,可以降低污染,進行多重擴增,克服了普通PCR的許多不足。

20世紀50年代以前,沙眼曾在我國廣泛流行,是當時致盲的首要病因,20世紀70年代后隨著生活水平的提高、衛(wèi)生常識的普及和醫(yī)療條件的改善,其發(fā)病率大大下降。沙眼患者往往缺乏典型的臨床表現(xiàn),如何能確診沙眼就要更多的依賴于先進的實驗室檢查技術。這樣才能更好的指導我們對早期及輕癥沙眼患者進行規(guī)范化治療,從而達到消滅沙眼的最終目標。

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