玉米種子純度室內(nèi)檢驗(yàn)方法的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用展望

趙欣欣，于運(yùn)國，崔克艷

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省遼源市龍山區(qū)工農(nóng)鄉(xiāng)政府 ）

種子純度是影響作物產(chǎn)量的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，種子純度每下降1%，就使作物產(chǎn)量下降1%左右。如果種子純度不達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)良品種則無法發(fā)揮其高產(chǎn)潛力。玉米在雜交制種時(shí)，親本種子純度低、去雄操作不及時(shí)不徹底、其他父本花粉的雜交、種子收獲及加工帶來的機(jī)械混雜等多種因素都會導(dǎo)致種子純度下降。做好玉米種子純度的檢驗(yàn)工作是控制假劣種子流入市場的重要措施。每年我國玉米新品種都大量涌現(xiàn)，玉米遺傳資源較狹窄又致使很多品種遺傳基礎(chǔ)較為相似，這些因素都給品種純度的檢驗(yàn)工作帶來新困難和新挑戰(zhàn)。玉米種子純度的室內(nèi)檢驗(yàn)是及時(shí)、快速測定種子純度的有效方法，其中包含的各種方法各具特點(diǎn)，成為眾多專業(yè)人士不斷探索和研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，尤其是現(xiàn)代檢測手段的出現(xiàn)，為種子純度檢驗(yàn)帶來了生機(jī)，也意味著現(xiàn)代種子純度檢驗(yàn)技術(shù)必將取代傳統(tǒng)落后方法而開創(chuàng)種子純度檢驗(yàn)的新時(shí)代。

1 籽粒和幼苗形態(tài)特征鑒別

籽粒和幼苗形態(tài)特征鑒別是分別根據(jù)玉米種子籽粒的外部形態(tài)（如粒型、粒色、粒頂部形狀及顏色及粉質(zhì)多少、胚大小及形狀、稃色等）和幼苗的芽鞘色的外觀性狀進(jìn)行鑒別。這種方法雖然簡單、直觀，但是生產(chǎn)上推廣的品種種類繁多，且雜交種多數(shù)與其母本自交系籽粒相同或相近，這些因素決定這種方法不適應(yīng)當(dāng)前的純度檢驗(yàn)需求。

2 以生化指紋為依據(jù)的電泳鑒別法

種子中的蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，不同品種的遺傳差異性則表現(xiàn)在它們所含有的蛋白質(zhì)種類及分子量大小，因此，通過凝膠電泳技術(shù)可以將不同品種的貯藏蛋白或同工酶組分的差異性表現(xiàn)出來，從而對種子純度進(jìn)行測定。目前，在我國以生化指紋為依據(jù)的電泳鑒別法被種子公司所廣泛采用[1]。

2.1 貯藏蛋白電泳鑒別法

目前，應(yīng)用和研究最廣泛的是玉米種子純度鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定方法，這項(xiàng)技術(shù)在2001年已被列入我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T449-2001），并在2001年11月11日實(shí)施[2]。該方法因簡單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，被種業(yè)界廣泛接受。很多研究者[3～6]對該項(xiàng)技術(shù)的操作技術(shù)及技巧進(jìn)行了大量的探索和研究。方玉春等[7]應(yīng)用該法分別對玉米雜交種和親本自交系進(jìn)行純度檢測，鑒定率為89%，同時(shí)還能有效區(qū)別單交種及其親本。令人擔(dān)憂的是，這種方法在盡顯優(yōu)勢的同時(shí)也表現(xiàn)出一定的局限性，即對親本為姊妹系、多環(huán)系、改良系等遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜的雜交種、特殊單交種(親本與雜交種譜帶極相似)及正反交種卻無法有效、準(zhǔn)確鑒別[8]?？梢?，種子純度室內(nèi)檢驗(yàn)需要新的更加有效的方法取而代之。

2.2 酯酶同工酶電泳鑒別法

酯酶同工酶聚丙烯酰胺電泳技術(shù)被研究者進(jìn)行一定研究[12，13]，發(fā)現(xiàn)測定玉米種子純度結(jié)果穩(wěn)定，譜帶清晰，特異性強(qiáng)，但由于酶的提取要求嚴(yán)格，且具有組織和器官特異性等特點(diǎn)，導(dǎo)致這種方法很難在生產(chǎn)上廣泛推廣和采用。

3 DNA分子標(biāo)記鑒別

品種的差異性實(shí)質(zhì)是品種間基因型的差別。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是通過直接分析DNA的多態(tài)性來診斷生物內(nèi)在基因的排布規(guī)律及其外在性狀的表現(xiàn)規(guī)律，通過鑒定DNA水平上的差異來鑒別品種。DNA指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用使品種純度的檢驗(yàn)由傳統(tǒng)技術(shù)達(dá)到分子水平，為品種純度鑒定提供了準(zhǔn)確、可靠、快速、方便的方法。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定有以下特點(diǎn)：（1）DNA分子標(biāo)記數(shù)量大，多態(tài)性水平高，可鑒定表型和電泳方法難以鑒別的品種；（2）不受時(shí)間和空間影響，即可在生長發(fā)育的任何階段取材鑒定；（3）分離出的樣品DNA可長期保存，這對于進(jìn)行追溯性或仲裁性鑒定非常有利。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)有三類，以雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo) 記 （RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片斷長度多態(tài)性)；以PCR反應(yīng)為核心的DNA指紋技術(shù) （RAPD：Randomly Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA、AFLP標(biāo)記：Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性、SSR標(biāo)記：Simple Sequence Repeats或 micro satellite DNA， 微 衛(wèi) 星 DNA、SCAR：Sequence– related Amplified Polymorphism,序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性等）；以測序?yàn)楹诵牡男滦偷姆肿訕?biāo)記（SNP：Single—nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性等）。這三類標(biāo)記對于種子純度鑒定并非都適用，比如以雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記因成本過高，操作極其繁瑣、復(fù)雜，很難在種子公司普及和推廣；而另外兩類標(biāo)記則表現(xiàn)出較強(qiáng)的可行性。

3.1 以PCR反應(yīng)為核心的DNA指紋技術(shù)

3.1.1 RAPD標(biāo)記技術(shù)：RAPD技術(shù)操作簡單、方便，只需PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，多態(tài)性高，成本較低，多位研究者[14～16]將其應(yīng)用于玉米種子純度的鑒定研究并證明了其可行性。盡管RAPD具有穩(wěn)定性和重演性差的缺點(diǎn)，但是顏廷進(jìn)[14]認(rèn)為，只要每一次反應(yīng)條件嚴(yán)格控制，就可以得到理想的重復(fù)結(jié)果。另外，林清也指出只要RAPD反應(yīng)具備以下條件，就能獲得理想的純度鑒定結(jié)果：①高質(zhì)量的DNA；②穩(wěn)定的PCR反應(yīng)條件；③穩(wěn)定的程序；④適宜的引物；⑤設(shè)置重復(fù)。

3.1.2 AFLP標(biāo)記技術(shù)：AFLP技術(shù)是限制性酶切、PCR和聚丙烯酰胺電泳相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，具有結(jié)果準(zhǔn)確、可靠且重演性好，DNA多態(tài)性高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了RFLP多態(tài)性檢出率低的缺點(diǎn)及RAPD技術(shù)對實(shí)驗(yàn)條件很敏感、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可靠性較差的缺點(diǎn)。這種方法在玉米種質(zhì)資源鑒定和類群劃分上得到廣泛研究[17，18]，但其缺點(diǎn)是操作技術(shù)較為繁瑣，并要求操作者具有一定的操作技能，而且成本較高（AFLP技術(shù)是一種專利技術(shù)，受專利保護(hù)），當(dāng)前使其在種子純度的快速檢測普及應(yīng)用仍存在一段距離。但是，如果該方法能簡化并降低成本，將成為極有推廣前途的一項(xiàng)種子純度檢測的實(shí)用技術(shù)。

3.1.3 SSR標(biāo)記技術(shù)：動、植物基因組中分布著許多由1～4個(gè)堿基對組成的簡單重復(fù)序列，每個(gè)座位上重復(fù)單位的數(shù)目及重復(fù)單位序列的差異產(chǎn)生多態(tài)性,這種多態(tài)性遠(yuǎn)多于 RFLP的多態(tài)性，是一種較為理想的DNA標(biāo)記技術(shù)，在玉米品種鑒定上進(jìn)行了廣泛的研究[20，21]。 吳明生[22]通過 SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測了 24份雜交玉米種子的純度，同時(shí)將鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，證實(shí)兩種方法檢測結(jié)果具有一致性，SSR分子標(biāo)記可以替代田間種植方法進(jìn)行玉米純度鑒定。由于該標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡便、快速的特點(diǎn)，非常適于在種子公司及管理部門推廣應(yīng)用，因此，當(dāng)前被認(rèn)為是用于玉米品種純度鑒定的最可靠且實(shí)用的分子標(biāo)記技術(shù)。

3.1.4 SRAP標(biāo)記技術(shù)：SRAP是在總結(jié)已有的DNA分子標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新型標(biāo)記技術(shù)。SRAP利用引物對ORF（開放性閱讀框）進(jìn)行擴(kuò)增，因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。這種標(biāo)記技術(shù)因引物具有設(shè)計(jì)簡單、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。SRAP不需要像SSR標(biāo)記那樣花費(fèi)人力物力進(jìn)行引物開發(fā)，比RAPD標(biāo)記穩(wěn)定；不需要像AFLP那樣需要預(yù)擴(kuò)增和連接，但擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性很豐富。SRAP標(biāo)記被用于玉米自交系遺傳多樣性的的劃分[23，24]，但在玉米種子純度的鑒定中未見報(bào)道，由于其強(qiáng)大的優(yōu)點(diǎn)在玉米種子純度的鑒定研究將具有廣泛的研究前景。

3.2 以測序?yàn)楹诵牡男滦偷姆肿訕?biāo)記

SNP是指群體中基因組 DNA序列上單個(gè)核苷酸的變異。目前，基于SNP的分子標(biāo)記已在人類和動物的疾病等方面進(jìn)行大量研究，在植物中擬南芥、水稻[25，26]也有相關(guān)研究報(bào)道。隨著玉米基因組測序的全面開展，以序列為基礎(chǔ)SNP標(biāo)記展現(xiàn)了巨大的利用潛力。

通過以上介紹不難看出，各種純度測定方法各具優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際種子純度檢測過程中應(yīng)根據(jù)具體情況加以選擇利用。籽粒形態(tài)鑒別法雖然較為粗糙，主觀性較強(qiáng)，但當(dāng)種子公司急于調(diào)種或村屯收種時(shí)，現(xiàn)場不具備檢驗(yàn)設(shè)備，檢驗(yàn)員可以憑借豐富的種子識別經(jīng)驗(yàn)，作為臨時(shí)方法用以鑒別種子的真實(shí)性，但之后必須采用可靠方法再進(jìn)行純度測定；但對于新育成的品種，檢驗(yàn)員不能熟練掌握其外部特征時(shí)或?qū)δ切┹^難識別的品種，此種方法應(yīng)慎用。

對種子純度可靠、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效地進(jìn)行檢測一直是人們關(guān)心和追求的焦點(diǎn)。目前，我國大中型種子公司測定玉米種子純度時(shí)都是以鹽溶蛋白聚丙烯酰胺電泳鑒定方法為主。這種方法對少數(shù)親本及其雜交種的區(qū)分以及遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的材料尚不能檢驗(yàn)和鑒別，可考慮采用分子標(biāo)記進(jìn)行鑒別。因此，方法的選擇應(yīng)以簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)為前提，盡管分子標(biāo)記技術(shù)比生化指紋鑒別更加準(zhǔn)確、可靠，但是相對來講測定成本較高，因此在實(shí)際工作中可作為生化指紋鑒別的補(bǔ)充方法。況且，目前我國中小型種子公司并不具備分子標(biāo)記測定的設(shè)備和條件，所以這項(xiàng)技術(shù)在推廣和使用上仍然受到限制。但從我國育種工作的發(fā)展現(xiàn)狀來看，隨著科技不斷進(jìn)步，新技術(shù)必然替代傳統(tǒng)技術(shù)，分子標(biāo)記方法將逐漸成為蛋白質(zhì)或同工酶電泳鑒定的替代方法。

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