RNA干擾在腫瘤治療研究中的應(yīng)用進(jìn)展

孫廓 張鍵 陳統(tǒng)一

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科,上海 200032)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種生物進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)的高度保守現(xiàn)象。1998年Fire證實(shí)Guo等[1]發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量?jī)?nèi)源或外源雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)所致并將這一現(xiàn)象命名為RNAi[2]。2000年Zamore等[3]確定RNAi發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的基因治療研究提供了一種新的方法,通過(guò)RNAi抑制基因的表達(dá)已成為腫瘤研究及治療的新策略。

1 RNAi的作用機(jī)制及特點(diǎn)

RNAi引發(fā)基因沉默都要經(jīng)過(guò)兩個(gè)保守的生物學(xué)過(guò)程:①起始階段不同來(lái)源的dsRNA被 Dicer(dsRNA-specific endonuclease)切割產(chǎn)生 siRNA(small interfering RNA)片斷;②效應(yīng)階段Dicer與核酸內(nèi)、外切酶及siRNA等一起形成核糖核苷酸蛋白復(fù)合物(RNA inducingsilencingcomplex,RISC),在ATP供能的條件下RISC中的核酸內(nèi)切酶切斷特異序列mRNA,mRNA殘基隨后迅速地被降解,從而沉默目的基因產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。RNAi具有高效特異性、遺傳性、長(zhǎng)度限制性與濃度、時(shí)間及ATP依賴性等幾個(gè)特點(diǎn)。

2 RNAi與腫瘤:治療性研究

現(xiàn)有的腫瘤治療方法有手術(shù)切除、放射治療和藥物化學(xué)治療,這些治療方法均不能特異性地殺傷及完全根除腫瘤,而且有較大的副作用。RNAi可使突變基因穩(wěn)定靜默,而不影響正?；虻谋磉_(dá),且具有簡(jiǎn)易性、特異性及高效性的特點(diǎn),在腫瘤的研究及治療上有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì),并取得一系列的成果。

2.1 RNAi與癌基因及抑癌基因 許多腫瘤的發(fā)生是由于染色體上某個(gè)基因突變,RNAi可以針對(duì)變異基因設(shè)計(jì)干擾片段,從而特異性抑制變異的mRNA表達(dá)。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)在大多數(shù)胃癌中過(guò)表達(dá),并與胃癌的發(fā)病相關(guān),RNAi抑制人胃癌細(xì)胞中的OPN的表達(dá),能有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[4]。研究表明腎癌細(xì)胞中檢測(cè)到OPN的表達(dá),利用siRNA下調(diào)OPN的表達(dá)后伴有線粒體相關(guān)凋亡通路的激活以及MMP-2和uPA等侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)下調(diào),顯著增加腫瘤細(xì)胞的凋亡同時(shí)減少其侵襲能力[5]。

Ras家族基因點(diǎn)突變與細(xì)胞癌變有關(guān)。Zhao等[6]發(fā)現(xiàn)敲除肝癌細(xì)胞中N-ras的表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G0/G1期,顯著抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Shi等也在胰腺癌細(xì)胞株中應(yīng)用 RNAi雙重沉默Ras/MAPK和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白K-ras和Akt2后,能有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,有望為腫瘤治療提供新的策略[7]。

2.2 RNAi與細(xì)胞凋亡抑制基因 在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中凋亡受抑是腫瘤細(xì)胞惡性克隆增殖的基礎(chǔ)。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一類結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì),目前已發(fā)現(xiàn)了8種IAP:X染色體相關(guān)IAP(XIAP),細(xì)胞IAP(c-IAP1,c-IAP2)、神經(jīng)元 IAP、Survivin、Apollon、Livin、和IAP樣蛋白-2。IAPs主要通過(guò)抑制特定的胱門蛋白酶來(lái)抑制細(xì)胞凋亡,在多種人腫瘤中可以檢測(cè)到 IAPs病理性的過(guò)表達(dá)。研究[8]發(fā)現(xiàn) c-IAP1,c-IAP2在骨肉瘤中表達(dá)升高,并且利用RNAi敲除c-IAP1,c-IAP2后可抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)。研究[9]報(bào)道利用RNAi在人結(jié)腸癌中封閉XIAP的基因表達(dá),可增強(qiáng)其對(duì)化療的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡并延緩腫瘤的生長(zhǎng)。Ku等[10]轉(zhuǎn)染SurvivinsiRNA至膀胱癌T24細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞停滯于G2/M期,明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。另有研究[11]報(bào)道利用RNAi沉默Survivin的表達(dá)后,可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,減少動(dòng)物模型中腫瘤成瘤率,延長(zhǎng)動(dòng)物生存期。

Bcl-2和Bcl-xl是Bcl-2抗凋亡蛋白家族的主要成員,作用是調(diào)控細(xì)胞生存和凋亡,在許多人腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)。研究[12]報(bào)道靶向Bcl-2和Bcl-xl的siRNA能增強(qiáng)各種因素誘導(dǎo)的腫瘤的細(xì)胞凋亡,并能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。利用RNAi沉默凋亡抑制基因有望成為腫瘤基因治療的一種很有前景的治療模式。

2.3 RNAi與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因 腫瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中,某些基因的改變可以導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一,其過(guò)表達(dá)是多種人原發(fā)性腫瘤的特征,對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后判定具有重要意義。Deharvengt等[13]在胰腺癌中利用靶向cyclin D1的shRNA降低cyclin D1蛋白水平,能減少腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)和侵襲及體內(nèi)腫瘤血管形成。cyclin E是一類核蛋白,調(diào)控細(xì)胞從G0或G1期進(jìn)入S期。Todd等[14]發(fā)現(xiàn)在70%的RB+/p16+卵巢腫瘤中cyclin E表達(dá)異常增高,利用siRNA抑制cyclin E的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞大量蓄積于G1期,從而認(rèn)為cyclin E是卵巢癌又一潛在的治療靶點(diǎn)。cyclin B1作為調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的正性調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞增殖中起到重要作用。Crombez等[15]在鼠荷瘤模型中利用瘤內(nèi)注射cyclin B1-siRNA后,可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。

2.4 RNAi與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程,腫瘤細(xì)胞通過(guò)運(yùn)動(dòng)穿破宿主結(jié)締組織、血管、淋巴管壁,從而進(jìn)入體液循環(huán),再次穿破結(jié)締組織、血管、淋巴管壁在靶器官定位形成轉(zhuǎn)移灶。Liu等[16]在前列腺癌中利用shRNA抑制OPN的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)同時(shí)下調(diào),導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞在體外的增殖、遷移及侵襲均受到抑制,同時(shí)抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。

尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一,在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Salvi等[17]通過(guò)選取高表達(dá)uPA的肝癌細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染 uPA-siRNA抑制uPA基因表達(dá),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力、浸潤(rùn)性和增殖力均下降,這有望成為新型的肝癌基因治療手段。Gondi等[18]同時(shí)阻斷uPA和uPA受體的表達(dá),結(jié)果顯示細(xì)胞色素C從線粒體中釋放并伴有caspase-8的激活,提示凋亡的發(fā)生。這些研究為多樣化利用RNAi研究腫瘤和治療腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Bmi-1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1)與許多人腫瘤的發(fā)生、增殖及侵襲性相關(guān),并被認(rèn)為是診斷腫瘤的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究[19]報(bào)道應(yīng)用RNAi抑制Bmi-1的表達(dá)可以顯著影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.5 RNAi與腫瘤血管生成相關(guān)基因 實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和增殖依賴于腫瘤血管的生成,這一過(guò)程取決于血管生成因子和抑制因子的相互拮抗和平衡。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial grow th factor,VEGF)被認(rèn)為是最主要的血管生成因子,其高水平表達(dá)是多種腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。VEGF能特異地促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖,可以促進(jìn)血管的生長(zhǎng)和側(cè)支循環(huán)的建立。Kim等[20]根據(jù)VEGF的基因序列設(shè)計(jì)了特異性的siRNA,轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞后腫瘤組織的血管密度和腫瘤體積顯著下降。另有研究[21]表明抑制VEGF的表達(dá)后可以抑制新生血管形成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,減小腫瘤體積。

缺氧誘導(dǎo)因子1-α是主要存在于實(shí)體腫瘤組織中的缺氧反應(yīng)性因子,在維持細(xì)胞能量代謝、腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用。研究報(bào)道在宮頸癌、上皮卵巢癌、胰腺癌及肝癌等中利用RNAi抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)后,可以有效地下調(diào)MMP-2,減少VEGF產(chǎn)物生成和血管形成,抑制腫瘤生長(zhǎng),具有腫瘤綜合治療的潛能。

2.6 RNAi與腫瘤耐受放化療相關(guān)基因 惡性腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)。目前越來(lái)越多的研究認(rèn)識(shí)到耐藥的機(jī)制包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、藥物排出增加及藥物誘導(dǎo)的凋亡逃避等[22]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)和P-gp是由MDR1基因編碼的膜蛋白超家族,具有廣泛的細(xì)胞功能,可調(diào)控藥物局部滲透,并激活宿主免疫系統(tǒng)等[23]。在不同的腫瘤模型體內(nèi)外轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)MDR1基因表達(dá),從而抑制P-gp蛋白或ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),可增加抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,增加化療敏感性。MDR1-siRNAs有望成為治療MDR1依賴性多藥耐藥腫瘤的治療新方法。Sun等[24]報(bào)道用靶向癌基因Ras-shRNA與長(zhǎng)春新堿聯(lián)合治療人肝癌細(xì)胞,結(jié)果表明下調(diào)Ras的表達(dá)可以消除長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的P-gp和MDR1過(guò)表達(dá),更有效的抑制人肝細(xì)胞肝癌的生長(zhǎng)。Mu等[25]對(duì)Bcl-XL的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)靶向siRNA處理的前列腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑更敏感。

放射治療導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要靶點(diǎn)是DNA,其中經(jīng)DNA雙鏈斷裂損傷最為重要。針對(duì)DNA雙鏈斷裂時(shí)信號(hào)修復(fù)蛋白ATM和PKC等亞單位設(shè)計(jì)siRNA是增強(qiáng)腫瘤放療敏感性的良好靶標(biāo)。Li等[26]應(yīng)用靶向ATM蛋白的siRNA可以減少該蛋白的表達(dá),從而顯著加強(qiáng)對(duì)放療的敏感性。XIAP的過(guò)表達(dá)與人類腫瘤耐受放療有關(guān),Wang等[27]設(shè)計(jì)靶向 XIAP的質(zhì)粒 shRNA,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人喉癌Hep-2細(xì)胞株,下調(diào)XIAP基因表達(dá)后腫瘤細(xì)胞明顯停滯于G0/G1期,并導(dǎo)致喉癌細(xì)胞的放療敏感性明顯增強(qiáng)。所以靶向敏感基因的siRNA聯(lián)合放化療無(wú)疑給腫瘤耐受傳統(tǒng)治療的患者帶來(lái)了新的希望。

3 展 望

RNAi作為一種新興的沉默特異基因序列的方法,以其快速、可靠、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)吸引了廣大科學(xué)研究者的關(guān)注,為各種腫瘤的基因療法提供了新策略。然而,RNAi的臨床應(yīng)用還存在著諸多問(wèn)題,如設(shè)計(jì)高度特異性的siRNA,非編碼區(qū)的RNA是否對(duì)RNAi敏感,如何將siRNA安全導(dǎo)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá),siRNA藥物的靶向傳遞系統(tǒng)及實(shí)際應(yīng)用的安全性等,這些問(wèn)題有待于科研工作者進(jìn)一步努力去解決。

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