外源性熱休克蛋白70基因?qū)π募〖毎麚p傷的保護作用

劉季春 萬 力 何 明

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科,江西南昌 330006;2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,江西南昌 330006)

熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)對心肌細胞損傷的保護作用引起國內(nèi)外心血管界的極大興趣與高度關(guān)注[1]。動物經(jīng)熱處理后其離體、在體心臟或經(jīng)熱處理后的心肌細胞均可誘導(dǎo)HSP70的生成,并可明顯改善缺血/再灌注損傷后左室收縮功能與心肌酶譜、縮小梗死面積、減輕心肌細胞超微結(jié)構(gòu)損傷。進一步研究提示:上述保護作用與 HSP70 mRNA和蛋白質(zhì)的表達量成正比[2],HSP70作為一種內(nèi)源性心肌保護物質(zhì),在心肌缺血預(yù)適應(yīng)的延遲保護作用中發(fā)揮重要作用[3]。本研究以脂質(zhì)體為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體,將高表達的pCDNA HSP70質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠心肌細胞,比較所表達的HSP70對心肌細胞急性實驗性缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷的保護作用及其與熱休克心肌細胞保護模型之間作用的異同,并對其機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SD新生大鼠(1～3 d),雌雄不拘,由江西醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物科學(xué)部提供。

1.2 大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng) 參照Spector等[4]方法略加改進,下列操作均在超凈工作臺內(nèi)進行。取30只出生1～3 d內(nèi)SD大鼠,消毒后開胸取出心臟,立即放入預(yù)冷的D-Hank液中,剪開心臟沖洗3次,取心室肌并剪成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊,加入無鈣、鎂 0.1%胰蛋白酶溶液 10 mL,36℃磁力攪拌8 min,吸取上層混懸液丟棄;再加入無鈣、鎂0.1%胰蛋白酶溶液10 mL于組織中消化8 min,再次移棄上清液;向組織中續(xù)加10 mL胰蛋白酶液消化,吸取消化后的上清液,加含15%FBS的MEM培養(yǎng)基10 mL,在溫度10℃環(huán)境中離心6 min,轉(zhuǎn)速1 000 r?min-1,再向組織加入0.1%胰蛋白酶溶液10 mL消化,反復(fù)多次,直到組織碎塊消化,細胞分離完畢。所收集的細胞用含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混懸后,置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣,37℃)培養(yǎng) 2 h,用差速貼壁法去除成纖維細胞,將懸浮的心肌細胞過200目不銹鋼網(wǎng),計算細胞懸液中臺盼藍復(fù)染的活細胞數(shù)達90%以上。用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5×105個?mL-1,之后分別按5×105個/孔和105個/孔接種于24孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板內(nèi),于37℃,5%CO2、95%空氣條件下培養(yǎng),隔天換培養(yǎng)液,開始3 d加入0.1 mM Brd U抑制纖維細胞生長。培養(yǎng)第3天進行隨機分組實驗。

1.3 大鼠心肌細胞A/R損傷模型與HS保護模型的制作

1.3.1 心肌細胞A/R液制備 參照Koyama等[4]和Xu等[5]方法,取培養(yǎng)相應(yīng)時間的心肌細胞,對培養(yǎng)的心肌細胞以缺氧、缺糖模擬缺血,以恢復(fù)氧和糖的供應(yīng)作為再灌注。模擬缺血溶液(NaH2PO4 0.9 mM,NaHCO3 6.0 mmol?L-1,CaCl2 1.8 mmol? L-1,MgSO41.2 mmol? L-1,HEPES 20 mmol? L-1,NaCl 98.5 mmol?L-1,KCl 10.0 mmol?L-1,p H 6.8,37℃)預(yù)先用95%N2、5%CO2混和氣體飽和1 h;模擬再灌注溶液(NaCl 129.5 mmol?L-1,KCl 5.0 mmol? L-1,NaH2PO40.9 mmol? L-1,NaHCO3 20 mmol?L-1,CaCl2 1.8 mmol?L-1,MgSO4 1.2 mmol?L-1,葡萄糖 55 mmol?L-1,HEPES 20 mmol? L-1,p H 7.4,37℃)預(yù)先用95%O2、5%CO2混和氣體飽和1 h。用模擬缺血溶液置換正常培養(yǎng)溶液即缺血,用模擬再灌注溶液置換缺血溶液即為再灌注。

1.3.2 心肌細胞A/R損傷模型 實驗時,棄培養(yǎng)液,換模擬缺氧液,將培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h,再換上模擬再灌注液,以95%O2、5%CO2進行復(fù)氧孵育2 h(37℃)。

1.3.3 心肌細胞HS保護模型 實驗分組后,即刻將HS組心肌細胞置入42℃中培養(yǎng)1 h;轉(zhuǎn)入正常心肌細胞培養(yǎng)48 h,再進行A/R損傷實驗。

1.4 p CDNA HSP70質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物和轉(zhuǎn)導(dǎo)人p CDNA HSP70質(zhì)粒由美國芝加哥大學(xué)王山鳴教授惠贈,經(jīng)擴增和純化,與脂質(zhì)體在室溫下混合10 min。按照操作說明書將該復(fù)合物與心肌細胞混合,完成心肌細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。

1.5 實驗分組 隨機分為4組,對照組、缺氧/復(fù)氧(A/R)組、熱休克處理后缺氧/復(fù)氧(A/R+HS)組和p CDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)后缺氧/復(fù)氧(A/R+pCDNA HSP70)組。每次實驗復(fù)孔,重復(fù)4次。處理時間按圖1進行。

1.6 細胞存活率 采用MTT比色法[6]檢測。心肌細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板,接種密度為105個/孔,每孔液體200μL。去培養(yǎng)液,復(fù)氧2 h后各組每孔加入MTT溶液(5 mg?mL-1)20μL,孵育4 h,每孔加入150μL DMSO,振蕩10 min,選擇490 nm 波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。設(shè)不加細胞只加孵育液的空白對照,記錄結(jié)果。細胞存活率=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.7 生化檢測 實驗結(jié)束后各組分別取孵育液200μL,用美國 Beckman生化自動分析儀測定LDH活性。

1.8 透射電鏡觀察 實驗結(jié)束后,先用細胞刮刮下細胞,用4℃預(yù)冷的 PBS清洗,2.5%戊二醛、1%鋨酸常規(guī)固定、脫水、包埋、超薄切片、醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。用日本H-600型透射電鏡觀察、攝片。

1.9 大鼠心肌細胞HSP70 mRNA檢測(RT-PCR)

提取大鼠心肌細胞總RNA,經(jīng)總RNA質(zhì)量、濃度檢測與標(biāo)化,建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。引物設(shè)計參照文獻[7];β-actin作為對照。HSP70引物:sense(5-AAC-GTG-CTG-CGG-ATC-ATC-AA-3);antisense(5-CTG-GAT-GGA-CGT-GTA-GAA-GT-3);產(chǎn)物長度為 347 bp。β-actin引物:sense(5-TCA-TCA-CCA-TTG-GCA-ATC-AG-3);antisense(5-GTC-TTG-GCG-TAC-AGG-3);產(chǎn)物長度為154 bp。PCR反應(yīng)條件如下:熱啟動:94℃2 min;變性:94℃45 min;退火:55℃45 min;延伸:72℃1 min;經(jīng)30個循環(huán)后,72℃3 min結(jié)束。取擴增產(chǎn)物15μL上樣,1.5%瓊脂糖凝膠電泳。定量計算方法為:所得HSP70產(chǎn)物帶與β-actin產(chǎn)物帶的綜合密度之比,再除以對照組相對應(yīng)樣本的此兩條帶綜合密度之比。

1.10 大鼠心肌細胞 HSP70蛋白檢測(Western blot) 用預(yù)冷PBS洗心肌細胞3遍。加預(yù)冷溶解緩沖液,6孔板:200μL/孔;60 mm培養(yǎng)皿:500 μL/板。4℃孵育60 min。用細胞刮棒把細胞碎片連同細胞裂解液集中于一側(cè),并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的Eppendorff管中。離心(12 000 g,4℃)10 min。取上清液,行心肌細胞總蛋白濃度的測定(Folin酚法)與標(biāo)化。取含同等蛋白量的樣本稀釋至等體積,和5×蛋白上樣緩沖液按4∶1體積混勻,100℃水浴5 min,趁熱加樣,每孔道10μL,加樣后凝膠放置于裝有電泳緩沖液的電泳槽進行電泳。隨后于轉(zhuǎn)移液中平衡10 min,120 mA×60 min轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后,將NC膜置TTBS漂洗液中,進行考馬斯亮藍法膠染。依次結(jié)合一抗和羊抗大鼠IgG-HRP二抗,顯影,曝光。將膠片掃描后,在醫(yī)學(xué)圖形分析系統(tǒng)上進行分析。計算方法為所得HSP70蛋白帶的綜合密度除以Control組相對應(yīng)樣本的綜合密度。

1.11 心肌細胞內(nèi)Ca2+的檢測[8]實驗結(jié)束后,棄去相應(yīng)的處理液,加入負(fù)載指示劑(Fluo-3的終濃度為2μM)避光37℃孵育30 min后用分離緩沖液(detach buffer)沖洗,并在分離緩沖液中孵育10 min。低速離心(1 000 g)收集洗脫的細胞,棄去上清液,并用測定緩沖液(assy buffer)重新懸浮細胞,于流式細胞儀上檢測,激發(fā)波長為488 nm,隨機測定單個心肌細胞的熒光強度值,取10萬個心肌細胞的熒光強度值的平均值為每份標(biāo)本的測定值。

1.12 數(shù)據(jù)處理 定量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進行方差齊性檢驗、單因素方差分析,組間比較用LSD法;定性資料用卡方檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞存活率 對照組大鼠心肌細胞存活率分別為86.2±10.9;HS+A/R組與pCDNA HSP70+A/R組存活率分別為 73.1±12.2、77.6±12.5,較A/R組顯著增加(33.8±7.3,P＜0.01),表明熱休克和pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)可對抗A/R損傷所致細胞存活率的下降。

2.2 各組心肌細胞培養(yǎng)液中 LDH活性 對照組大鼠心肌細胞培養(yǎng)液中LDH活性為2.3±0.4,HS+A/R組與pCDNA HSP70+A/R組培養(yǎng)液中LDH 活性分別為 12.1±2.7、10.9±2.3,較 A/R組(20.6±3.4)明顯降低(P＜0.01),表明熱休克和pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)可對抗A/R損傷所致細胞培養(yǎng)液中LDH活性升高。

2.3 各組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)改變 電鏡下,A/R組心肌細胞肌原纖維排列尚整齊,肌漿網(wǎng)明顯擴張呈空泡狀,線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)破壞,嵴紊亂、稀疏;HS+A/R組、pCDNA HSP70+A/R組心肌細胞肌原纖維排列整齊、橫紋清晰,線粒體結(jié)構(gòu)基本正常,表明熱休克與pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)均可有效地對抗大鼠心肌細胞A/R所致的細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

2.4 各組心肌細胞HSP70mRNA表達 在對照組心肌細胞未見有HSP70 mRNA的表達。A/R組心肌細胞可見有少量的HSP70mRNA表達,而HS+A/R組、pCDNA HSP70+A/R組心肌細胞表達顯著增加,分別是A/R組的1.82±0.26倍和2.05±0.33倍(P＜0.01),兩者間也有顯著差異(P＜0.01),表明心肌細胞的熱休克保護模型及pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)均已成功,且后者增加HSP70 mRNA作用更強。

2.5 各組心肌細胞HSP70蛋白表達 對照組心肌細胞未見有HSP70蛋白表達。A/R組心肌細胞可見有少量 HSP70蛋白表達,而 HS+A/R組、pCDNA HSP70+A/R組心肌細胞表達顯著增加,分別是A/R組的2.33±0.31倍和3.26±0.42倍(P＜0.01),兩者間也有顯著差異(P＜0.01),表明心肌細胞熱休克保護模型及pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)均已成功,且后者增加HSP70的表達作用更強。

2.6 各組心肌細胞內(nèi)Ca2+的改變 扣除背景的熒光量后,對照組心肌細胞內(nèi)Ca2+為11.84±1.37,A/R組為 23.21±2.81,明顯高于對照組(P＜0.01);而 HS 組、pCDNA HSP70組分別為 15.56±1.62、14.24±1.65,明顯低于 A/R 組(P＜0.01),表明熱休克和pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)可對抗大鼠心肌細胞A/R損傷所致的細胞內(nèi)Ca2+升高。

3 討 論

研究表明,許多應(yīng)激原(包括熱休克、缺血、壓力和容量負(fù)荷、藥物)都能誘導(dǎo)心肌表達HSP70。更有實際意義的是通過熱處理增加細胞熱耐受力的同時,也增加了對其他應(yīng)激原的耐受,反之亦然,即交叉保護現(xiàn)象[9]。因此如何迅速誘導(dǎo)HSP70高水平表達具有臨床意義。目前,提高心肌細胞HSP70含量的方法有兩類:誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP70表達和導(dǎo)入外源性HSP70基因。熱休克預(yù)處理與缺血預(yù)處理是誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP70表達的經(jīng)典方法。但這兩種方式因其固有的創(chuàng)傷性及保護作用的時間局限性,且無法預(yù)測心血管疾病的發(fā)生和預(yù)處理的難控制性,不能作為一種臨床療法進行治療。

用某些藥物進行干預(yù)、誘導(dǎo),即藥理性缺血預(yù)適應(yīng)保護,確實可有效誘導(dǎo)HSP70蛋白在心肌細胞中表達,產(chǎn)生心肌保護作用。實驗證明,中藥有效成分阿魏酸鈉[10],可誘導(dǎo)HSP70蛋白表達,對大鼠急性心肌細胞損傷產(chǎn)生藥理性缺血預(yù)適應(yīng)保護。

近年研究提示,利用分子生物學(xué)技術(shù),將外源性HSP70基因?qū)胄募〖毎幸蕴岣逪SP70基因的表達水平,也可保護心肌免遭急性損傷?；虔煼ㄊ请S著分子生物學(xué)進展而出現(xiàn)的一種全新治療方法。任何基因療法需采用安全、方便、無毒的措施將目的基因傳遞至靶細胞或靶器官。向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移目的基因的方法可分為兩大類:病毒載體途徑和非病毒載體途徑。但以病毒為載體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不但安全性問題尚未完全解決,而且無法估計插入宿主細胞內(nèi)基因長期穩(wěn)定表達所引起的遠期生物效應(yīng)之利弊[11],使其臨床應(yīng)用受到極大的限制。

在本研究中,我們將pCDNA HSP70轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞內(nèi),經(jīng)48 h孵育,成功誘導(dǎo)出HSP70mRNA及其蛋白的高表達,其與同步進行的熱處理誘導(dǎo)出的HSP70蛋白一樣,表現(xiàn)出強大的抗急性A/R損傷作用。使在遭受急性A/R損傷后,心肌細胞存活率大幅度提高,細胞培養(yǎng)液中LDH、CPK等心肌損傷標(biāo)記物活性明顯降低,細胞超微結(jié)構(gòu)基本接近正常;利用pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得的心肌保護效果與熱休克預(yù)處理無明顯差異,表明外源HSP70基因表達可起到保護作用,反之也證明HSP70是熱休克預(yù)處理中起主要作用的因子。

心肌缺血再灌注損傷的主要病理生理學(xué)改變之一是心肌細胞內(nèi)的游離鈣含量急劇增加,出現(xiàn)鈣超載。本研究證實:急性 A/R處理使心肌細胞內(nèi)Ca2+含量明顯增加;熱休克處理可抑制這種增加;pCDNA HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)所引起HSP70蛋白高表達,在使心肌細胞急性A/R損傷明顯減輕的同時,也可對抗這種增加;提示HSP70蛋白對抗急性心肌細胞損傷的作用至少部分與對抗細胞內(nèi)Ca2+含量的增加、防止心肌細胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

綜上所述,HSP70蛋白作為生物體內(nèi)廣泛存在的一種應(yīng)激蛋白,可快速、短暫調(diào)整應(yīng)激過程中細胞的存活機能,保護細胞免遭損傷,并有助于細胞恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和機能。在急性心肌損傷過程中不論用何種方法誘導(dǎo)出的HSP70蛋白,均可有效地對抗大鼠急性心肌損傷。其抗損傷機制與對抗細胞內(nèi)Ca2+含量的增加、防止心肌細胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

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