間充質干細胞治療椎間盤退變性疾病的研究進展

朱偉榮綜述 李春海，葉 偉審校

椎間盤退變性疾病（degenerative disc disease，DDD）是指由椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）引起的一系列疾病如腰椎間盤突出癥、頸椎病、椎間盤源性疼痛、椎管狹窄癥以及脊柱節(jié)段不穩(wěn)等的總稱。治療DDD的傳統(tǒng)方法包括保守治療和手術治療，可以在一定程度上緩解部分臨床癥狀，但未能從根本上解決椎間盤本身的病變問題，切除椎間盤還可因脊柱不穩(wěn)而導致退變的進一步惡化。近年來，隨著組織工程學和細胞生物學的不斷發(fā)展，退變椎間盤的生物學修復漸成脊柱外科的研究熱點之一，人們可以通過生物學干預手段逆轉或減緩椎間盤的退變以恢復其生物學功能，從而為DDD治療問題的根本性解決帶來了希望。

細胞治療是治療椎間盤退變性疾病極具潛力的生物學方法之一。椎間盤的種子細胞主要有纖維環(huán)內層細胞、纖維環(huán)與髓核移行區(qū)細胞、髓核內軟骨樣細胞、骨髓間充質干細胞（bone marrow mesen-chymal stem cells，BM-MSCs）、脂肪間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cells，AMSCs）等。其中間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）來源豐富，具有很強的自我增殖和多向分化潛能，可分泌多種細胞因子和生長因子，且分化潛能相對有限，較之胚胎干細胞形成腫瘤的可能性更小，因此被認為是理想的骨組織工程種子細胞。但MSC的誘導分化是關鍵和難點，影響其分化的因素很多，如局部微環(huán)境的改變、其他相鄰細胞的作用、細胞因子的刺激等。本文就近幾年來MSC治療椎間盤退變性疾病的相關研究進展進行綜述。

1 BM-MSCs

BM-MSCs是一群存在于骨髓中的非造血干細胞，來源充足，取材方便，體外分離培養(yǎng)操作簡單，細胞數量可通過培養(yǎng)獲得大量擴增，免疫原性低，移植引起的排斥反應相對較輕，便于外源基因的轉染和表達調控。自2003年Sakai等[1]首次將BM-MSCs作為椎間盤組織工程的種子細胞以來，眾多學者對其在椎間盤退變性疾病的應用進行了大量基礎研究。

1.1 BM-MSCs與椎間盤細胞或組織的共培養(yǎng)

諸多體外研究表明，BM-MSCs與椎間盤細胞的共培養(yǎng)可促進髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPC）增殖，提高Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量；培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件對這一過程產生重要影響。Tao等[2]對新西蘭大白兔椎間盤NPC和BM-MSCs分別進行直接接觸和非直接接觸培養(yǎng)（即在NPC和BM-MSCs兩種細胞之間隔一有小孔且允許可溶性因子通過的半透膜），發(fā)現直接接觸培養(yǎng)方式中BM-MSCs呈環(huán)狀聚集，且Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖（aggreacan）和sox-9基因表達明顯增加，而非直接接觸培養(yǎng)方式則無明顯變化。Richardson等[3]用人NPC和BM-MSCs以不同比率分別進行直接接觸和非直接接觸培養(yǎng)，發(fā)現采用前種方式培養(yǎng)7 d后，BM-MSCs的Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、多（功）能（蛋白）聚糖和sox-9等髓核標志基因明顯增加，且與細胞比率有關，當NPC與BM-MSCs之間的比率為75:25時增加最明顯；但對于非接觸培養(yǎng)系統(tǒng)而言，無論細胞比率如何變化，系統(tǒng)中以上髓核標志基因均無明顯改變。Sobajima等[4]對人NPC和BM-MSCs在不同比率下共培養(yǎng)，當NPC與BM-MSCs之間比率為75:25和50:50時蛋白多糖和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）等細胞外基質的合成最多。張福勇等[5]還報道了兔纖維環(huán)細胞和BM-MSCs共培養(yǎng)的初步研究結果，發(fā)現在離心管中三維培養(yǎng)條件下，兔纖維環(huán)細胞與BM-MSCs共培養(yǎng)能夠促進增殖，增加Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量。

在近期的研究中，人們探討了NPC和BM-MSCs之間相互作用的機制，如分化、刺激效果以及細胞融合等。Yang等[6]報道了非直接接觸的BM-MSCs和NPC培養(yǎng)系統(tǒng)通過分泌可溶性因子對細胞增殖和基質成分表達所產生的影響，結果表明，與NPC共培養(yǎng)后BM-MSCs增殖呈上升趨勢，Ⅰ型膠原和Fas伴隨的死亡結構域蛋白表達顯著下降，最初不表達的Ⅱ型膠原在共培養(yǎng)后開始表達；與少量BM-MSCs共培養(yǎng)后NPC增殖即顯著上升，增加BM-MSCs的數量并不能進一步促進NPC的增殖，而聚集蛋白聚糖的表達隨BM-MSCs數量的增加而增強。故其認為，BM-MSCs和NPC的相互作用可能是可溶性因子或直接接觸交換細胞成分相互影響的結果。有研究認為細胞融合可能與成體干細胞可塑性以及其在組織工程中的潛能有關[7]，但Vadalà等[8]在允許各種細胞因子相互作用的三維共培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現，細胞融合與NPC、BM-MSCs相互作用下的BM-MSCs可塑性無關，同時發(fā)現NPC可誘導BM-MSCs的基因譜轉向軟骨形成的基因，提示BM-MSCs向軟骨樣細胞的分化。Umeda等[9]將大鼠NPC分別與BM-MSCs、全骨髓細胞（bone marrow cells，BMC）培養(yǎng)，結果顯示，與BMC共培養(yǎng)時NPC增殖、基質合成、聚集蛋白聚糖mRNA表達、硫酸鹽及脫氧胸腺嘧啶苷攝取均明顯增加，提示BMC中包含了除BM-MSCs外的重要細胞，推測可能是造血干細胞。

Wei等[10]的報道揭示了大鼠BM-MSCs與大鼠完整椎間盤組織共培養(yǎng)的結果，培養(yǎng)后第14天、30天BM-MSCsⅡ型膠原、聚集蛋白聚糖和sox-9的表達上調，而這些改變在BM-MSCs單獨培養(yǎng)時并未檢測到，提示完整椎間盤可影響B(tài)M-MSCs的分化途徑，由椎間盤中的細胞和細胞外基質的分子或信號提供的三維微環(huán)境可誘導BM-MSCs向軟骨分化。

1.2 BM-MSCs的局部微環(huán)境

研究發(fā)現，BM-MSCs局部微環(huán)境的變化對BM-MSCs向椎間盤細胞的分化起到了至關重要的作用[11]。Wuertz等[12]從成熟和年幼的大鼠骨髓中分離出BM-MSCs并分別在低糖、高滲、酸性環(huán)境和三者的復合條件下單層培養(yǎng)2周，發(fā)現低糖環(huán)境可以刺激聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原的表達以及細胞增殖，高滲和酸性條件下細胞增殖和基質蛋白的表達明顯減少，三者復合條件下則表現為抑制作用，提示滲透壓和pH值對BM-MSCs的影響較大。其后續(xù)研究進一步探討了pH值對不同年齡大鼠BM-MSCs分化的影響，在pH值為7.4、7.1、6.8、6.5的條件下分別培養(yǎng)3～4周和4～5月齡SD大鼠BM-MSCs 5 d，結果顯示，隨著酸度的增加，兩組均能下調聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原蛋白以及金屬蛋白酶組織抑制劑-3的表達，抑制細胞增殖，降低細胞活性，同時引起細胞形態(tài)的改變，但高齡組受酸度的影響相對較小[13]。Felka等[14]分別在有無IL-1β及是否低氧的四種胎牛血清中培養(yǎng)人BM-MSCs 28 d之后發(fā)現，無IL-1β低氧組形成的細胞微團最大，無IL-1β含氧量正常組次之，含IL-1β低氧組再次，含IL-1β含氧量正常組最小，蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白表達的信號強度亦出現類似的結果，提示IL-1β等炎性介質抑制了BM-MSCs向軟骨的分化，而低氧條件有助于移植后BM-MSCs的軟骨分化和表型穩(wěn)定。

1.3 BM-MSCs與支架材料

理想的支架材料應具備生物相容性好、可降解、免疫原性低等特點，因此支架材料的選擇是保證BM-MSCs移植效果的關鍵點。有學者研究了以端膠原、復合藻酸鹽凝膠、多聚左旋乳酸等作為支架材料時移植的BM-MSCs對退變椎間盤的修復作用[1，15-16]。Crevensten 等[17]在退變的大鼠椎間盤中分別注入含或不含BM-MSCs的透明質烷凝膠，含BM-MSCs組凝膠注入后即在相應節(jié)段觀察到熒光標記的BM-MSCs，第7天、14天仍可見BM-MSCs，但數量明顯減少，第28天時恢復到最初的數量且細胞全部成活；其椎間盤高度與不含BM-MSCs組相比亦有增加的趨勢，提示BM-MSCs可在椎間盤存活和增殖。Revell等[18]亦在吸取髓核后的豬椎間盤中分組注入透明質烷來源的多聚體代用材料HYAFF-R120和含自體BM-MSCs的HYADD-R3，6周后發(fā)現僅髓核吸取組正常椎間盤結構喪失（如纖維化、終板破裂等），而HYAFF-R120以及含自體BM-MSCs的HYADD-R3均可阻止這一改變，且形成了髓核樣區(qū)域，它類似于正常椎間盤的雙凸結構并含有活性軟骨細胞形成基質。

1.4 BM-MSCs移植后的變化

近年來眾多學者對不同動物實驗模型中BM-MSCs移植后的變化以及對椎間盤退變的影響進行了探討。Sobajima等[4]將同種異體BMMSCs移植到兔 L2/3、L3/4、L4/5椎間盤髓核，移植 24周后椎間盤組織切片中仍能觀察到BM-MSCs，且未見受體動物發(fā)生系統(tǒng)性疾病，提示BM-MSCs在實驗動物體內至少可存活24周；顧蕊等[19]采用顯微注射方法將兔BM-MSCs注入兔腰椎間盤，術后60 d外源性BM-MSCs在活體兔椎間盤內仍處于存活狀態(tài)；孫禹等[20]觀察了移植BM-MSCs在兔椎間盤內的分化情況，發(fā)現在椎間盤環(huán)境的影響下，BM-MSCs可分化為軟骨樣細胞，從而為BMMSCs抑制椎間盤退變提供了證據。Jeong等[21]對雌性SD大鼠尾骨2/3、3/4、4/5節(jié)段進行放射學及組織學觀察，結果顯示，BM-MSCs移植組能夠維持椎間高度，保持信號強度，移植后兩周BMMSCs仍存活；而鹽水注入組椎間高度逐漸丟失。

Hiyama等[22]對小獵犬椎間盤退變模型的實驗結果表明，BM-MSCs移植可抑制蛋白聚糖和水含量的下降，進而抑制椎間盤退變并維持椎間盤的免疫豁免狀態(tài)。研究還發(fā)現，移植前FasL僅在基因水平表達，移植8周后在髓核區(qū)域檢測到FasL蛋白的表達，推測BM-MSCs移植可能通過BM-MSCs分化成可表達FasL的細胞來獲得椎間盤免疫豁免狀態(tài)的維持，故認為BM-MSCs移植可能直接引起退變椎間盤免疫豁免狀態(tài)的恢復，亦可能間接通過刺激髓核細胞增加FasL的表達而獲得免疫豁免狀態(tài)的恢復。Wei等[23]將人骨髓干細胞移植到退變的大白鼠椎間盤中，42 d后在注入干細胞的椎間盤中仍可檢測到用熒光標記的包括BM-MSCs在內的CD－細胞，且3周后分化成為具有軟骨細胞表型（表達Ⅱ型膠原和Sox-9）的細胞，而熒光標記的CD+細胞21 d后就已無法檢測到。此外，在未應用免疫抑制劑的情況下，髓核未見炎癥細胞浸潤且移植后宿主椎間盤細胞和注入的干細胞中FasL蛋白表達均上調。鮑軍平等[24]評價了BM-MSCs在兔椎間盤退變早期植入椎間盤后細胞外基質的表達情況，結果顯示，8周內實驗組髓核蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量明顯較模型組高，提示兔BM-MSCs移植可以延緩甚至阻止髓核退變，從而為青少年椎間盤突出癥患者的臨床治療提供了新的思路。

2 AMSCs

脂肪來源的間充質細胞在體外條件下具有分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞等多種細胞類型的潛能。相較于BM-MSCs，AMSCs具有來源更為廣泛、取材簡單、獲取過程損傷程度小、產率高等優(yōu)勢，因此在細胞治療領域有著廣泛的發(fā)展空間。

Li等[25]的研究表明，新西蘭兔AMSCs在不同的分化條件下可向成脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化；AMSCs與髓核共培養(yǎng)時Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的基因表達比藻酸鹽單獨培養(yǎng)或與纖維環(huán)共培養(yǎng)時增加2～3倍。Tapp等[26]還發(fā)現，沙鼠在三維培養(yǎng)條件下AMSCs受TGFβ刺激后可產生富含蛋白多糖和Ⅰ型膠原的細胞外基質，且蛋白多糖比AMSCs單獨三維培養(yǎng)時增加48%；另外，AMSCs與人纖維環(huán)細胞共同在三維條件下培養(yǎng)時蛋白多糖含量比AMSCs與纖維環(huán)細胞單獨三維培養(yǎng)時的總和還多20%。Lu等[27]將AMSCs和NPC共培養(yǎng)于僅允許可溶性小分子通過的非接觸小室，結果發(fā)現，在微按摩法共培養(yǎng)條件下，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖基因表達上調并伴骨橋蛋白、Ⅰ型膠原和過氧化物酶體增生物激活受體表達下調，提示NPC可通過分泌可溶性因子誘導AMSCs髓核樣細胞表型分化；而在單層培養(yǎng)中，NPC迅速去分化，失去軟骨樣表型，Ⅰ型膠原表達增加。提示微按摩法培養(yǎng)的三維構型不僅對維持NPC的表型是必需的，而且對NPC的誘導分化性能也是必需的。此外，為研究Ⅱ型膠原和NPC在三維環(huán)境下對AMSCs的影響，Lu等[11]分別將AMSCs與Ⅰ型、Ⅱ型膠原單獨培養(yǎng)和在Ⅰ型、Ⅱ型膠原、NPC中共培養(yǎng)（小室微按摩法），單獨培養(yǎng)后第4天僅Ⅹ型膠原上調，未觀察到其他軟骨形成標記；在共培養(yǎng)條件下，與在Ⅰ型膠原中相比，AMSCs在Ⅱ型膠原中可觀察到更顯著的ⅡA、ⅡB膠原和蛋白聚糖基因上調，且在Ⅱ型膠原單獨培養(yǎng)及與NPC共培養(yǎng)中均可見到細胞聚集，而后者細胞聚集時間顯著延遲，認為可能與整聯(lián)蛋白α2基因下調有關。

以上證據從不同角度關注了MSC修復退變椎間盤的研究，從而為DDD的治療提供了新的方法。至于BM-MSCs和AMSCs誰更適合做軟骨的種子細胞，有人認為BM-MSCs比AMSCs更具優(yōu)勢，亦有研究顯示AMSCs和BM-MSCs在多向分化潛能上無明顯差別[28,29]，這一問題有待進一步深入的探討。

總而言之，盡管有關DDD的MSC細胞治療已取得了可喜的進展，但該領域的研究仍停留在體外培養(yǎng)和動物實驗階段，有許多難題需要解決和面對，如：移植細胞的類型、細胞移植是否采用支架、細胞移植后的營養(yǎng)途徑；椎間盤退變的確切機制、髓核細胞的表型或特征、老化或退變椎間盤的細胞和分子改變；應用細胞治療的恰當時機和遠期效果；控制增殖、避免形成腫瘤的方法等等。但隨著研究的不斷深入，相信在不久的將來，對DDD的細胞治療及相關生物治療會取得突破性進展。

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