血竭酊的質(zhì)量控制

程洪兵， 韓石蕊， 趙永旗， 邵海榮(濮陽(yáng)市人民醫(yī)院，河南 濮陽(yáng)457000)

血竭酊是本院應(yīng)用多年的醫(yī)院制劑(制劑文號(hào):豫藥制字Z04090080)，由血竭、丹參、赤芍、川芎、紅花等組成，臨床實(shí)踐證實(shí)，本制劑具有活血化瘀、消腫止痛之功效，主要用于跌打損傷、軟組織損傷等癥的治療。本研究制定了該制劑中丹參、赤芍、川芎、紅花的薄層色譜定性鑒別及君藥血竭中血竭素的含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

美國(guó)Waters 515高效液相色譜儀;瑞士Precisa電子天平(型號(hào):92SM-202A)。血竭素高氯酸鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為:110811-200704);丹參對(duì)照藥材、赤芍苷對(duì)照品、川芎對(duì)照藥材、紅花對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為120923-200509;110736-200628;120918-200608;120907-200609);薄層色譜用硅膠G及硅膠GF254(青島海洋化工有限公司);血竭酊(批號(hào)分別為080923，081215，090312，090528)及陰性樣品均由濮陽(yáng)市人民醫(yī)院制劑室提供;乙腈、甲醇為色譜純;磷酸二氫鈉、磷酸、鹽酸、醋酸鈉、三氯甲烷、乙醚等均為分析純;水為注射用水。

2 方法

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹參 取本品30 mL，置水浴上濃縮至約15 mL，加乙醚振搖提取3次(15、10、10 mL)，合并乙醚提取液，回收乙醚至約10 mL;先用1%鹽酸10 mL洗滌，再用1%氫氧化鈉溶液10 mL洗滌，將洗滌后的乙醚液，濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。按樣品的制備工藝制備缺丹參的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取丹參對(duì)照藥材粉末1 g，加乙醚10 mL，置具塞試管中，振搖，放置1 h，濾過(guò)，自“先用1%鹽酸10 mL洗滌”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-甲醇(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液則無(wú)此斑點(diǎn)。

2.1.2 赤芍 取2.1.1項(xiàng)下乙醚萃取后的水層溶液，置水浴上濃縮至約10 mL，用1%鹽酸調(diào)pH至2～3，再用水飽和的正丁醇提取3次(15、10、10 mL)，合并正丁醇提取液，置水浴上揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。按樣品的制備工藝制備缺赤芍的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取赤芍苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液則無(wú)此斑點(diǎn)。

2.1.3 川芎 取本品20 mL，水浴濃縮至約10 mL，再加入三氯甲烷振搖提取3次(15，10，10 mL)，合并三氯甲烷液，濃縮至約2 mL，作為供試品溶液。按樣品的制備工藝制備缺川芎的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取川芎對(duì)照藥材1 g，加60%乙醇30 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-乙酸乙酯(10∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液則無(wú)此斑點(diǎn)。

2.1.4 紅花［1］391取本品40 mL，水浴濃縮至約20 mL，加水飽和的正丁醇振搖提取3次(20、10、10 mL)，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，離心，取上清液，作為供試品溶液。按樣品的制備工藝制備缺紅花的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取紅花對(duì)照藥材1 g，加60%乙醇50 mL，煎煮1 h，用脫脂棉乘熱濾過(guò)，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醚(3∶2)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15 min，展開(kāi)，取出，晾干，在氨蒸氣中熏15 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯一個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液則無(wú)此斑點(diǎn)。

2.2 血竭素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(49∶51);流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):440 nm;柱溫:40℃;理論塔板數(shù)按血竭素計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品9.66 mg，加3%磷酸甲醇溶液制成每1 mL含血竭素高氯酸鹽38.64 μg的溶液(相當(dāng)于28.06 μg的血竭素)(每1 mg血竭素高氯酸鹽相當(dāng)于0.726 mg的血竭素)作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含血竭素高氯酸鹽19.32 μg的溶液(相當(dāng)于14.03 μg的血竭素)，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品20 mL，水浴蒸發(fā)至約10 mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，并用三氯甲烷10 mL分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，加入三氯甲烷振搖提取4 次(15、15、10、10 mL)，合并三氯甲烷液至錐形瓶中，水浴(溫度不超過(guò)70℃)揮干;精密量取3%鹽酸溶液25 mL，置上述錐形瓶中，超聲提取45 min，濾過(guò);精密量取續(xù)濾液20 mL置分液漏斗中，再加10%醋酸鈉溶液20 mL，振搖，加入乙醚提取4 次(30、20、10、10 mL)，合并乙醚液，水浴(溫度不超過(guò)70℃)揮干;加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中不含血竭的其它藥材同比例制備陰性樣品，按2.2.3項(xiàng)下的方法操作，制成陰性對(duì)照溶液。供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系的考察 分別精密量取對(duì)照品貯備液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別吸取10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定血竭素峰面積。以血竭素進(jìn)樣濃度(C:μg/mL)對(duì)血竭素峰面積(A)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A=14.161C－4.519，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，血竭素進(jìn)樣濃度在8.42～22.45 μg/mL范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.6 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，以峰面積計(jì)算，RSD為1.28%(n=5)，表明儀器精密度良好。室溫放置，于 0、1、2、4、8、12 h 分別進(jìn)樣 10 μL，記錄峰面積基本不變，RSD為1.63%，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取同一批號(hào)的樣品(批號(hào)080923)5份，依照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，計(jì)算血竭酊的平均含量為13.74 μg/mL，RSD為1.39%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)得血竭素含量(13.74 μg/mL)的同一批號(hào)樣品(批號(hào)080923)6份，分別精密加入血竭素對(duì)照品溶液，依照2.2.3項(xiàng)下方法操作，制備溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血竭素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.9 樣品含量測(cè)定 分別精密量取3批血竭酊(批號(hào)為081215，090312，090528)，依照2.2.3項(xiàng)下的方法制備3份供試品溶液，分別吸取對(duì)照品溶液和3份供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血竭酊中血竭素含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 血竭的主要成分為血竭素、血竭紅素、(2s)-5-甲氧基-6-甲基黃烷-7醇等［2］。血竭為血竭酊的君藥，具有活血祛瘀、消腫止痛、收斂止血生肌之功效，選血竭中含量較高的血竭素作為本制劑的含量控制項(xiàng)，能反映本制劑的質(zhì)量。用血竭入藥的散劑、丸劑、貼劑等劑型，有采用高效液相色譜法測(cè)定血竭素含量的報(bào)道［3］［1］308，629-630，尚未見(jiàn)高效液相色譜法測(cè)定酊劑中血竭素含量的報(bào)道。

3.2 在含量測(cè)定項(xiàng)的供試品溶液制備過(guò)程中，樣品曾采用三氯甲烷提取、蒸干、甲醇溶解等步驟處理，液相圖譜顯示成分太多，血竭素峰形相對(duì)較小且分離度不好。依據(jù)文獻(xiàn)［4］，樣品經(jīng)三氯甲烷提取揮干、鹽酸溶液超聲溶解、加入20%醋酸鈉后乙醚萃取揮干、甲醇溶解等步驟，干擾成分明顯減少，血竭素峰分離度好。又進(jìn)一步對(duì)鹽酸溶液濃度(1%、3%、5%)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示3%鹽酸溶液提取最完全。超聲時(shí)間考察了30 min、45 min、60 min，三者峰面積45 min大于30 min，60 min和45 min無(wú)明顯差別，確定超聲時(shí)間為45 min。對(duì)血竭酊的取樣量、提取溶劑的種類(lèi)及提取次數(shù)等均作了研究，結(jié)果為文中所述條件最優(yōu)。

3.3 配制血竭素高氯酸鹽對(duì)照品溶液，作紫外光譜掃描，在440 nm處有最大吸收，故選作440 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。曾比較流動(dòng)相比例40∶60、45∶55、49∶51，在流動(dòng)相比例為49 ∶51時(shí)保留時(shí)間最合適。柱溫40℃和室溫條件下比較，前者峰形對(duì)稱(chēng)性好，無(wú)拖尾，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

［1］中國(guó)藥典［S］.2005.

［2］馬秋菊，閔 菊.血竭的鑒別［J］.中成藥，2007，29(1):附11-12.

［3］李宏志.HPLC法測(cè)定骨突貼中血竭素的含量［J］.中國(guó)藥事，2008，22(4):340-341.

［4］鄭虎占，董澤宏，佘靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用［M］.北京:學(xué)苑出版社，1998:1922-1926.