高效液相色譜法測(cè)定七味柏苓片中鹽酸小檗堿和五味子乙素的含量

謝曉燕， 張忠君， 于春英

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117;2.一汽總醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000;3.吉林大藥房;吉林 長(zhǎng)春130000)

長(zhǎng)期以來，醫(yī)院制劑存在著申報(bào)手續(xù)簡(jiǎn)單、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)普遍偏低的問題，這樣就導(dǎo)致了制劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制以及成品出廠檢驗(yàn)過程中，都缺少質(zhì)量控制的指標(biāo)。因此我們對(duì)我院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重新進(jìn)行了修訂，作為內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來控制制劑成品的質(zhì)量。

七味柏苓片為我校附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要用于治療婦女濕熱內(nèi)蘊(yùn)所致的帶下癥。本實(shí)驗(yàn)在其原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加了黃柏和五味子的含量測(cè)定，即采用高效液相色譜法檢測(cè)鹽酸小檗堿和五味子乙素的含量，結(jié)果表明該方法先進(jìn)、具有可操作性，能夠控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器:LC-2010A型高效液相色譜儀(日本島津)，SPD-10 Avp紫外檢測(cè)器，UV-3000型紫外分光光度儀(日本島津)。

1.2 試藥:鹽酸小檗堿對(duì)照品及五味子乙素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)為0713-200107、765-9202);七味柏苓片由本院制劑室制備(批號(hào)為20070401、20070402、20070403);乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的 Kromasil柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);乙腈-0.04%三乙胺溶液(40∶60)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;流速0.8 mL/min;柱溫:30℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用甲醇-鹽酸(100∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，上中性氧化鋁柱(100～200目，內(nèi)徑1.5 cm，高5 cm)，用甲醇洗脫，收集洗脫液于25 mL量瓶中，收集至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按供試品溶液制備時(shí)的取樣量，折算成除黃柏外，處方中其余藥材的取樣量，按制備工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液，即得。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液 2、4、8、10、15 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=4 447 748.61X－57 993.56，r=0.999 9，結(jié)果表明對(duì)照品在0.073 6～0.552 0 g范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，依法測(cè)定，RSD為0.66%(n=5)。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，分別進(jìn)樣5次，依法測(cè)定，記錄峰面積積分值，計(jì)算，考察精密度，RSD為0.46%(n=5)。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，共5份，依法獨(dú)立測(cè)定，RSD為1.75%。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取同法測(cè)定的已知含量樣品，精密加入對(duì)照品溶液適量，依法測(cè)定，平均回收率為97.44%，RSD為1.96%(n=5)。結(jié)果見表1。

2.1.10 樣品測(cè)定 取3批樣品，按2.1.3項(xiàng)制備供試品溶液，每批3份，分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算3批樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2，圖1～3。

2.2 五味子乙素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為填

表1 鹽酸小檗堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 3批樣品鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

圖1 鹽酸小檗堿對(duì)照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

圖3 陰性對(duì)照HPLC圖

充劑的 ZORBAX-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);甲醇 －0.1%磷酸溶液－四甲基氫氧化銨(82∶18∶0.1)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:0.8 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取五味子乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解于100 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加氯仿80 mL回流提取4 h，氯仿液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庥?mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按供試品溶液制備時(shí)的取樣量，折算成除五味子外處方中其余藥材的取樣量，按制備工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液，即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2 805 703X－13 505，r=0.999 9，結(jié)果表明對(duì)照品在0.336 25～2.017 5 g范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，依法測(cè)定，RSD為0.64%(n=5)。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液6 μL，分別進(jìn)樣5次，依法測(cè)定，記錄峰面積積分值，計(jì)算，考察精密度，RSD為0.45%(n=5)。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，共5份，依法獨(dú)立測(cè)定，RSD為1.01%。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取同法測(cè)定的已知含量樣品，精密加入對(duì)照品溶液適量，依法測(cè)定，平均回收率為98.29%，RSD為2.66%(n=5)。結(jié)果見表3。

2.2.10 樣品測(cè)定 取3批樣品，按2.2.3項(xiàng)制備供試品溶液，每批3份，分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算3批樣品中五味子乙素的含量，結(jié)果見表4，圖4～6。

表3 五味子乙素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 3批樣品五味子乙素含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 鹽酸小檗堿含量測(cè)定曾參考文獻(xiàn)［1-4］及多次試驗(yàn)后選擇用乙腈－0.04%三乙胺溶液(40∶60)為流動(dòng)相。

圖4 五味子乙素對(duì)照品HPLC圖

圖5 供試品HPLC圖

圖6 陰性對(duì)照品HPLC圖

3.2 參照相關(guān)的文獻(xiàn)［1-4］及根據(jù)五味子乙素的理化性質(zhì)，采用氯仿直接回流提取?？疾焯崛r(shí)間，提取4 h后，再提取半小時(shí)，用TLC法檢查提取液是否含有五味子乙素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取4 h基本上可提取完全。

3.3 醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在普遍偏低的問題，多數(shù)是按藥典各劑型項(xiàng)下的要求檢驗(yàn)，一部分增加了薄層鑒別項(xiàng)，少數(shù)具有含量測(cè)定項(xiàng)。我們?cè)诖藢?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上會(huì)對(duì)其他制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，以期全面提高我院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005.

［2］何燕萍，蔡 陽(yáng)，朱珍燕.復(fù)方中成藥慢肝寶沖劑中五味子乙素的含量測(cè)定［J］.中國(guó)中藥雜志，1995，20(9):541-543.

［3］譚生建，曲雪蓮，楊成勇，等.肝復(fù)康丸中五味子甲素和五味子乙素含量測(cè)定方法研究［J］，解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，(16)5:270-272.

［4］將 平，文永盛，吳艷輝，等.五子衍宗丸中五味子乙素的含量測(cè)定［J］.中國(guó)藥師，2006，(9)9-10.