UPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定燈盞細(xì)辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量

鄭 林， 王永林， 王愛民， 喬 希， 官志忠， 蘭燕宇*

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550004;2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550004)

燈盞細(xì)辛又名燈盞花，為菊科植物短葶飛蓬［Erigeron breviscapus(Vant.)hand-Mazz.］的干燥全草，主產(chǎn)于云南、貴州、廣西、四川等地，具有祛風(fēng)散寒，活血通絡(luò)止痛等功效;國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上已開發(fā)出該藥的凍干粉針、注射液、膠囊劑、片劑、滴丸等單味藥制劑，主要用于治療心腦血管疾病、眼科疾病及老年性疾病，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景［1］。燈盞細(xì)辛中的化學(xué)成分主要含有黃酮類、咖啡酸酯類、酚酸類化合物以及其它類化合物。目前燈盞細(xì)辛及制劑中多采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)野黃芩苷單一成分進(jìn)行含量測(cè)定［2，3］，不能全面反映其質(zhì)量。本研究采用超高效液相色譜(UPLC)法，建立了同時(shí)快速、高靈敏測(cè)定燈盞細(xì)辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷含量的新方法，查閱國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)，未見有關(guān)定量分析的報(bào)道。并對(duì)不同產(chǎn)地?zé)舯K細(xì)辛藥材此3種成分進(jìn)行了測(cè)定研究，為進(jìn)一步完善燈盞細(xì)辛的質(zhì)量控制體系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

液相色譜儀為美國(guó)Waters公司Acquity UPLC系統(tǒng)，包括二元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower色譜工作站。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照品、藥材

綠原酸(批號(hào)110753-200212)、野黃芩苷(批號(hào)110842-200403，純度為97.12%)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;飛蓬苷對(duì)照品自制(系從燈盞細(xì)辛藥材中提取分離，經(jīng)UV、IR、NMR和MS鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC歸一化檢查，純度大于98%以上)。

燈盞細(xì)辛樣品來源于云南、貴州和四川等地，并經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院龍慶德副教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱定粉碎過40目篩的燈盞細(xì)辛樣品約0.5 g，精密加入50% 甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品飛蓬苷14.16 mg、綠原酸6.25 mg、野黃芩苷12.91 mg，置于25 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷濃度分別為0.566 4，0.250 0，0.501 5 mg/mL混合對(duì)照品貯備液。

2.2 色譜條件

色譜柱:Acquity BEH C18(2.1 mm ×150 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脫(0 min，2%A;3 min，5%A;4 min，13%A;6 min，15%A;7 min，18%A;9 min，19%A;9.1 min，80%A;10 min，80%A);流速:0.35 mL/min;柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm(檢測(cè)飛蓬苷)，326 nm(檢測(cè)綠原酸)和335 nm(檢測(cè)野黃芩苷);進(jìn)樣量:1 μL。在此條件下，飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷與其他組分分離完全，理論塔板數(shù)均不低于10 000。對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液 0.5，1，2，4，6，8 mL置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，分別進(jìn)樣1 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。飛蓬苷回歸方程為Y=4 934 909X－7 794，r=0.999 9;綠原酸回歸方程為Y=7 287 380X－11 541，r=0.999 6;野黃芩苷回歸方程為Y=4 944 101X+1 346，r=0.999 8;結(jié)果表明飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷濃度分別在28.32～453.12，12.50～200，25.08 ～401.20 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取上述飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷混合對(duì)照品溶液(濃度分別為 113.28，500.00，100.30 μg/mL)重復(fù)進(jìn)樣 6 次，測(cè)定峰面積。飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷峰面積的RSD(n=6)為0.76%，0.46%，0.82%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批燈盞細(xì)辛樣品(貴州雷山樣品)，共6份，按“2.2.1項(xiàng)供試品溶液”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的平均含量(n=6)分別為1.60%，0.82%，2.42%;RSD(n=6)分別為1.26%，1.52%，1.16%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

圖1 對(duì)照品(A)與貴州雷山樣品(B)UPLC色譜圖

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(貴州雷山樣品)，分別在 0，1，2，4，8，12 h進(jìn)樣分析，測(cè)得飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.69%，1.33%，1.56%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取6份已知含量的燈盞細(xì)辛(貴州雷山樣品)約0.25 g，分別按相當(dāng)于藥材中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷100%的量精密加入混合對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，求得飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷回收率平均值(n=6)分別為101.43%，97.49%，99.38%;RSD分別為1.72%，1.61%，2.04%。

2.8 樣品測(cè)定

取收集的不同產(chǎn)地的燈盞細(xì)辛藥材，按“2.1.1供試品溶液”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量。14批藥材含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地?zé)舯K細(xì)辛樣品中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的選擇

近年來隨著燈盞細(xì)辛研究的深入，發(fā)現(xiàn)除了以野黃芩苷為代表的黃酮類成分外，其所含的酚酸類成分和其它小分子化合物也是燈盞細(xì)辛中不可忽視的活性成分［4］。筆者從燈盞細(xì)辛中分離鑒定出了飛蓬苷、綠原酸等化合物，且在藥材中含量較高。本文同時(shí)測(cè)定了燈盞細(xì)辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量，為更客觀地評(píng)價(jià)燈盞細(xì)辛的質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 提取方法的選擇

中國(guó)藥典2005年版一部［5］與《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)［6］燈盞細(xì)辛含量測(cè)定項(xiàng)下的方法在提取方法、提取溶劑上有較大差異。為此，對(duì)兩種測(cè)定方法進(jìn)行了試驗(yàn)比較，結(jié)果表明藥典方法測(cè)定結(jié)果明顯偏低，分析其原因，主要是藥典法采用三氯甲烷索式提取后甲醇索提的方法對(duì)野黃芩苷提取不完全所致。因此，我們?cè)凇顿F州省中藥材，民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》燈盞細(xì)辛回流提取方法的基礎(chǔ)上，對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，以50%甲醇回流提取2 h綜合指標(biāo)較好，具有操作簡(jiǎn)便、快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 檢測(cè)條件的選擇

本研究采用UPLC方法，在10 min內(nèi)即可同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定燈盞細(xì)辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷的含量;UPLC作為HP LC分析方法的一種突破，為中藥多成分復(fù)雜體系的分析提供了一種新的強(qiáng)有力工具。試驗(yàn)曾對(duì)不同配比流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫分離效果較好。利用二極管陣列檢測(cè)器(PDA)檢測(cè)，得到各波段的三維色譜及光譜圖，其色譜峰與相應(yīng)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間及紫外光譜一致;飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷分別在260，326，335 nm有最大吸收，飛蓬苷在300 nm后基本無吸收，綠原酸和野黃芩苷在260 nm附近為吸收波谷，在同一波長(zhǎng)下的測(cè)定結(jié)果不甚理想，因此，采用PDA選擇在各成分最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，提高了檢測(cè)靈敏度。經(jīng)過方法學(xué)考察，證明本方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。

3.4 測(cè)定結(jié)果分析

經(jīng)對(duì)不同產(chǎn)地的燈盞細(xì)辛中飛蓬苷、綠原酸和野黃芩苷含量測(cè)定，表明本方法能達(dá)到有效分離各組分的目的，可作為燈盞細(xì)辛的質(zhì)量控制方法;同時(shí)表明不同地域的燈盞細(xì)辛中3種成分的含量存在明顯差異，說明生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間和儲(chǔ)存條件等可能對(duì)含量產(chǎn)生影響。上述結(jié)果提示，為保證燈盞細(xì)辛相關(guān)制劑批次間質(zhì)量的一致性，應(yīng)加強(qiáng)燈盞細(xì)辛的質(zhì)量控制，必要時(shí)固定藥材的來源。

［1］楊 莉.燈盞花制劑的臨床應(yīng)用［J］.四川中醫(yī)，2007，25(3):40-42.

［2］王淑紅，熊 英，王祥紅.加速溶劑萃取法用于燈盞細(xì)辛中燈盞乙素的測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2006，26(5):703-705.

［3］戴 航，侯小濤，謝植轟，等.益脈康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，2008，30(6):11-13.

［4］孫漢董.現(xiàn)代化是中藥與植物藥發(fā)展的必由之路［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，27(1):3-5.

［5］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:100.

［6］貴州省藥品監(jiān)督管理局編.貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).2003年版［S］.貴陽(yáng):貴州科技出版社，2003:172.