不同干燥方法對六味地黃生物制劑延長果蠅壽命的影響

宋 濤， 吳亞軍， 朱 穎， 夏少秋， 趙 越

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

六味地黃方是滋陰補(bǔ)腎經(jīng)典名方，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓六味中藥組成。藥理學(xué)研究表明，該方具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌等作用。光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是一類能進(jìn)行光合作用而不產(chǎn)氧的特殊生理類群的原核生物的總稱［1］。具有提高動物的存活率、增強(qiáng)抗病力、抗輻射、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性和生物轉(zhuǎn)化功能，近年來在醫(yī)藥食品領(lǐng)域的應(yīng)用倍受關(guān)注。六味地黃生物制劑是指經(jīng)光合細(xì)菌代謝的六味地黃湯。它是以光合細(xì)菌為菌種，加入到六味地黃復(fù)方中藥提取液中，按現(xiàn)代發(fā)酵工藝制成的生物制品，它是含有中藥活性成分、菌體及其代謝產(chǎn)物的新型中藥生物制劑。研究表明，六味地黃湯經(jīng)光合細(xì)菌代謝后，在增強(qiáng)免疫、抗衰老［2］和治療腎陰虛證模型小鼠［3］等方面的作用增強(qiáng)，優(yōu)于傳統(tǒng)的六味地黃湯;本實(shí)驗(yàn)對六味地黃湯光合細(xì)菌代謝液分別進(jìn)行了減壓干燥﹑噴霧干燥和真空冷凍干燥，以果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間為指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥組對果蠅壽命的影響與未干燥組沒有顯著性差異，而噴霧干燥組和減壓干燥組與未干燥組有顯著性差異，證明了真空冷凍干燥法在干燥六味地黃生物制劑中的優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

真空冷凍干燥機(jī)(CHRIST德國生產(chǎn));EYELA spray dryer SD－1000噴霧干燥機(jī)(日本生產(chǎn));ZK－82A型電熱真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)，BOXUN SPX－250B－Z型恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，廣口三角瓶(50 mL)，白砂糖、瓊脂、玉米粉、酵母粉(均為食品級);丙酸、乙醚(均為分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

美國野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。收集8 h內(nèi)羽化未交配果蠅，雌雄分開，用普通培養(yǎng)基在溫度為(25±1)℃，相對濕度為(60±5)%環(huán)境中培養(yǎng)。間隔12 h給予光照。

1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基

培養(yǎng)基I:為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其主要成分:水180 mL，白糖13 g，瓊脂1.3 g，玉米粉17 g，酵母粉1.4 g，丙酸1 mL。以未干燥的和經(jīng)冷凍干燥法﹑噴霧干燥法﹑減壓干燥法干燥后的六味地黃生物制劑占培養(yǎng)基0.3%的含量加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，依次配成培養(yǎng)基Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 干燥方法 真空冷凍干燥法

先將盛有50 mL樣品溶液的不銹鋼金屬盒放入低溫冰箱溫度－35℃冷凍8 h，此時(shí)樣品凍結(jié)完全，之后迅速放入真空冷凍干燥箱中，開真空泵，使內(nèi)部壓強(qiáng)降低，此時(shí)進(jìn)入升華干燥階段。當(dāng)去掉制品內(nèi)的自由水分以后，再除去樣品中的結(jié)合水后備用。

噴霧干燥法

取樣品適量，以進(jìn)風(fēng)溫度190℃，霧化壓力12 kPa，進(jìn)料速度600 mL/h噴霧干燥，干燥后立即置于密封袋，封口后放入干燥器內(nèi)保存，備用。

減壓干燥法

用量杯量取50 mL樣品，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，在60℃減壓干燥(－0.08 mPa)至恒重備用。

1.4.2 果蠅壽命實(shí)驗(yàn) 收集8 h內(nèi)新羽化黑腹果蠅成蟲，乙醚麻醉分雌雄;在空白對照培養(yǎng)基中飼養(yǎng)20 d后，隨機(jī)分組試驗(yàn)。每組果蠅90只，♀♂各半。每4天更換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)開始后，每天定點(diǎn)觀察，記錄果蠅死亡數(shù)，直到各組果蠅全部死亡為止。前半數(shù)果蠅生存時(shí)間為半數(shù)死亡時(shí)間，全部果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為平均壽命，最后10只果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為最高壽命，統(tǒng)計(jì)各組果蠅平均壽命，最高壽命，半數(shù)死亡時(shí)間。

2 果蠅壽命試驗(yàn)結(jié)果

在果蠅生存試驗(yàn)的評判標(biāo)準(zhǔn)中評價(jià)指標(biāo)有最高壽命、平均壽命和半數(shù)死亡時(shí)間3種。其中平均壽命是最重要的指標(biāo)，半數(shù)死亡天數(shù)和平均最高壽命則作為輔助指標(biāo)［4］。由表1表2可知，在雌性果蠅壽命試驗(yàn)中，與未干燥組比較，冷凍干燥組果蠅的平均壽命，最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間均低于未干燥組，但差異不顯著;噴霧干燥組和減壓干燥組果蠅的平均壽命，最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間均低于未干燥組，差異極為顯著(P＜0.001)。與普通對照組比較，未干燥組和冷凍干燥組果蠅的平均壽命，最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間均高于普通對照組，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.001);噴霧干燥組和減壓干燥組果蠅的平均壽命，最高壽命，半數(shù)死亡時(shí)間均高于普通對照組，但差異不顯著。在雄性實(shí)驗(yàn)組中，結(jié)果與雌性組相似，說明不同干燥方法干燥六味地黃生物制劑后對果蠅壽命的影響，顯示性別差異不明顯。

表1 不同干燥方法六味地黃生物制劑對雌性果蠅壽命的影響(±s)

表1 不同干燥方法六味地黃生物制劑對雌性果蠅壽命的影響(±s)

各干燥組與未干燥組比較，※P＜0.05，※※P ＜0.01，※※※P＜0.001;各組與空白對照組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

/d空白對照組組別 數(shù)量/只 半數(shù)死亡時(shí)間/d 最高壽命/d 平均壽命90 41.69±6.18 64.70±2.21 49.16±9.41未干燥組 88 49.23±8.92*** 71.40±1.50*** 57.09±10.62***冷凍干燥組 89 46.04±7.93*** 70.60±1.58*** 55.03±11.17**噴霧干燥組 88 42.57±7.65※※ 66.60±2.12※※※ 51.34±10.80※※※減壓干燥組 87 42.55±8.48※※※ 65.80±1.93※※※ 51.26±11.07※※※

表2 不同干燥方法六味地黃生物制劑對雄性果蠅壽命的影響(±s)

表2 不同干燥方法六味地黃生物制劑對雄性果蠅壽命的影響(±s)

各干燥組與未干燥組比較，※P＜0.05，※※P ＜0.01，※※※P＜0.001;各組與空白對照組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

/d空白對照組組別 數(shù)量/只 半數(shù)死亡時(shí)間/d 最高壽命/d 平均壽命90 41.82±6.67 64.60±2.22 49.27±9.49未干燥組 85 49.51±7.73*** 70.70±1.49*** 56.92±9.76***冷凍干燥組 85 46.76±7.72*** 70.20±1.32*** 55.52±10.89**噴霧干燥組 86 42.58±7.36※※ 65.90±2.38※※※ 51.40±10.63※※※減壓干燥組 85 42.39±7.64※※※ 65.20±2.20※※※ 50.64±10.49※※※

3 討論與分析

果蠅是一種真核多細(xì)胞生物，具有生活史短、繁殖率高、飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點(diǎn)。它的生長發(fā)育、繁殖衰老、許多代謝途徑、生理學(xué)功能和發(fā)育階段同哺乳動物基本相似，故常被用于生存與衰老實(shí)驗(yàn)研究［5］。

本試驗(yàn)通過真空冷凍干燥組，噴霧干燥組，減壓干燥組對六味地黃生物制劑延長果蠅壽命試驗(yàn)與未干燥組比較，結(jié)果顯示，噴霧干燥組和減壓干燥組無論是果蠅的平均壽命、最高壽命還是半數(shù)死亡時(shí)間均低于未干燥組，并且有顯著性差異。原因可能是由于噴霧干燥雖然持續(xù)時(shí)間相對較短，但干燥過程中的高溫使六味地黃生物制劑中的延緩果蠅衰老的活性成分遭到破壞;減壓干燥時(shí)溫度比噴霧干燥低，但是由于持續(xù)時(shí)間長，同樣使制劑中的活性成分遭到破壞。通過噴霧干燥組和減壓干燥組與普通對照組的比較發(fā)現(xiàn)，兩組在評價(jià)果蠅壽命的3個(gè)指標(biāo)上均高于空白對照組，但差別不顯著，說明噴霧干燥法和減壓干燥法對六味地黃生物制劑中的活性成分破壞較大。冷凍干燥組與未干燥組比較中，在3個(gè)指標(biāo)上均低于未干燥組，但差異都沒有顯著性;與空白對照組比較中，3個(gè)指標(biāo)均高于空白對照組，差別都有顯著性，說明真空冷凍干燥法在干燥六味地黃生物制劑過程中對活性成分造成的損失量較小。3種干燥方法中，真空冷凍干燥法在保存六味地黃生物制劑活性成分方面具有明顯的優(yōu)越性。

真空冷凍干燥能充分地保留被干燥物料的營養(yǎng)成分與活性物質(zhì)，保持物料原有的天然色澤、風(fēng)味以及形態(tài)，同時(shí)，真空冷凍干燥是一種使物料在低溫低壓下脫水的干燥工藝，與其他干燥方法相比，具有藥品不變質(zhì)、易長期儲存、藥劑定量準(zhǔn)確、脫水徹底、易復(fù)水再生、易進(jìn)行無菌操作、利于熱敏性藥物保持活性、揮發(fā)成分損失少等優(yōu)點(diǎn)［6］。本試驗(yàn)通過比較研究證明了真空冷凍干燥能較大限度地保持六味地黃生物制劑延長果蠅壽命的時(shí)間，體現(xiàn)了真空冷凍干燥技術(shù)在干燥六味地黃生物制劑中的優(yōu)越性，為研制六味地黃生物制劑新產(chǎn)品提供了依據(jù)。

［1］史國富.光合細(xì)菌在醫(yī)藥保健品方面的應(yīng)用進(jìn)展［J］.科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2003，13(7):99－100.

［2］臧建偉，胡旭光，唐春萍，等.六味地黃湯生物制劑的抗衰老作用［J］.中草藥，2007，38(1):99－100.

［3］王德秀，胡旭光，臧建偉，等.六味地黃湯生物制劑對腎陰虛小鼠HPA 軸的調(diào)節(jié)作用研究［J］.陜西中醫(yī)，2008，29(3):374－375.

［4］厲曙光，張 輝，周宇紅.鐵路餐車廚房烹調(diào)剩油對黑腹果蠅壽命的影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2002，1(18):45－46.

［5］王秀琴，黃淑峰，羅 娟，等.疊氮化鈉對果蠅壽命及某些抗氧化酶活力的影響［J］. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2008，35(4):281－285.

［6］宋 濤，吳亞軍，趙 越.減壓干燥和冷凍干燥對六味地黃生物制劑中丹皮酚和沒食子酸含量的影響［J］.中成藥，2009，31(12):1948－1950.