CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞型在結(jié)直腸癌組織中分布和臨床意義的研究①

蓋曉東 趙麗微 歷 春 （北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖教研室,吉林 132013）

CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞型在結(jié)直腸癌組織中分布和臨床意義的研究①

蓋曉東 趙麗微 歷 春 （北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖教研室,吉林 132013）

目的:探討CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）及其亞型在結(jié)直腸癌組織（colorectal carcinoma,CRC）的分布和臨床病理特征的關(guān)系。方法:收集42例CRC新鮮手術(shù)標(biāo)本,應(yīng)用冰凍切片、免疫組織化學(xué)SP法檢測腫瘤組織和癌旁組織中FOXP3+陽性細(xì)胞數(shù),分析其與臨床病理特征的相關(guān)性;應(yīng)用雙重免疫組化檢測FOXP3和ICOS表達(dá),分析FOXP3+ICOS+Treg和FOXP3+ICOS-Treg兩種細(xì)胞亞型分布情況。結(jié)果:CRC患者腫瘤組織中FOXP3分布顯著多于癌旁組織,差異顯著（P＜0.001）;中低分化組Treg細(xì)胞數(shù)明顯高于高分化組（P＜0.01）;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Treg細(xì)胞數(shù)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）;無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組Treg細(xì)胞數(shù)明顯高于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）;FOXP3+ICOS+Treg細(xì)胞亞群在CRC組織中高表達(dá),與癌旁組織相比差異顯著（P＜0.01）。結(jié)論:CRC的發(fā)生發(fā)展與其癌組織局部微環(huán)境中Treg數(shù)量變化相關(guān),Treg在CRC組織過量表達(dá)可能是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要因素之一;抑制CRC微環(huán)境中浸潤性Treg細(xì)胞功能可提高腫瘤局部免疫治療效果。

結(jié)直腸癌;Treg;FOXP3;ICOS

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer,CRC）目前仍然是導(dǎo)致人類死亡的惡性腫瘤之一。目前主要的治療手段是采用包括手術(shù)在內(nèi)的綜合治療,但是化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時,也殺傷正常細(xì)胞,限制了治療的療效。免疫系統(tǒng)對腫瘤存在特異性和非特異性應(yīng)答,其機制十分復(fù)雜,涉及多種免疫細(xì)胞及其分泌的產(chǎn)物。因此,研究CRC組織微環(huán)境下免疫細(xì)胞的分布情況,將有助于了解這種疾病的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制,探索新的治療方法。

研究表明,機體可通過多種免疫機制來殺傷CRC腫瘤細(xì)胞,而腫瘤細(xì)胞本身也可利用不同的方式來逃逸這些防御機制。許多腫瘤抗原為自身抗原,腫瘤內(nèi)浸潤的FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells,Treg）細(xì)胞能抑制T細(xì)胞對外來和自體抗原的免疫應(yīng)答,因而在維持對自身成分耐受的同時也會阻止機體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。

Treg代表一群獨特的CD4+輔助性T細(xì)胞亞群,在控制自身免疫中發(fā)揮著重要作用。CD4+CD25+是其主要的分子表型。FOXP3屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是控制Treg發(fā)育及其功能效應(yīng)的關(guān)鍵因素,也是Treg較特異且可靠的標(biāo)記[1-3]。最新研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)人胸腺、扁桃體、淋巴結(jié)和外周血中FOXP3+Treg細(xì)胞表面是否表達(dá)ICOS分子,可以將其分成FOXP3+ICOS+Treg和FOXP3+ICOS-Treg兩種細(xì)胞亞型[4]。

本研究通過酶標(biāo)免疫組化法檢測CRC腫瘤組織和癌旁組織中Treg的分布,雙重免疫組化法檢測Treg亞型的表達(dá),探討Treg在CRC組織的分布與臨床病理特征的相關(guān)性及其亞型的表達(dá)情況,為臨床CRC的免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和主要儀器

1.1.1 試劑 小鼠抗人FOXP3單克隆抗體、小鼠抗人ICOS單克隆抗體均為eBioscience公司產(chǎn)品;即用型免疫組化超敏SP試劑盒、免疫組化雙染試劑盒、DAB顯色試劑盒、多聚賴氨酸均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品;OCT包埋劑為SHANDON公司產(chǎn)品;其它均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 材料 本實驗共收集北華大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科2007年10月至2009年4月間結(jié)直腸癌手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本42例,其中結(jié)腸癌19例,直腸癌23例;年齡在 36～79歲之間,平均年齡59.9±13歲;男28例,女14例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實,并有詳細(xì)的臨床資料。所有病例均未行放、化療及生物免疫治療。

每例標(biāo)本均采集了結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織（避開壞死、炎癥區(qū)域）、癌旁組織（取自相應(yīng)腫塊旁3～5 cm腸組織）。標(biāo)本離體后OCT包埋,迅速置于-196℃液氮中速凍,后轉(zhuǎn)移至-85℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器 恒溫冷凍切片機（CM1900）為德國Leica公司產(chǎn)品;超低溫冰箱為日本SANYO產(chǎn)品;顯微鏡（Olympus cx21）為日本Olympus產(chǎn)品;數(shù)碼顯微鏡（Motic DM-BA400）、圖像采集系統(tǒng)（Motic Images Advanced 3.2）均為中國重慶Motic公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 所有標(biāo)本制成5μm厚冰凍切片,按免疫組化SP試劑盒說明進行單染色法檢測FOXP3蛋白表達(dá),雙染色法檢測FOXP3蛋白和ICOS蛋白的表達(dá),用PBS代替一抗作為陰性對照。Treg細(xì)胞陽性標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞形態(tài)完整,結(jié)構(gòu)清晰,棕黃色顆粒特異性定位于細(xì)胞核。FOXP3+ICOS+Treg陽性標(biāo)準(zhǔn):黑色和紅色顆粒同時特異定位于細(xì)胞核（黑色）與細(xì)胞膜（紅色）。采用雙盲法進行觀察,隨機對每張切片選擇10個高倍視野（400×）計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),求其平均值。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織病理學(xué)特征 42例CRC腫瘤組織分化程度根據(jù)惡性腫瘤的組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)（Breders分級）,全部病例分為高、中-低分化兩組;臨床分期根據(jù)1986年中國全國大腸癌會議提出的Dukes分期方法修正方案及2002年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）提出的大腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[5];原發(fā)腫瘤浸潤深度參照2002年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

2.2 CRC組織中Treg的分布 FOXP3+Treg細(xì)胞形態(tài)完整,結(jié)構(gòu)清晰,DAB顯色核呈棕黃色,散在分布于腫瘤組織中,尤其在癌組織與正常組織交界處分布密集。本實驗42例CRC組織中均有FOXP3+表達(dá),其表達(dá)水平24.1±6.3顯著高于癌旁組織0.7±2.0,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著（P＜0.001）（表2,圖1）。

2.3 CRC組織Treg分布與臨床病理特征的關(guān)系對CRC組織中Treg分布與臨床病理特征進行分析,結(jié)果表明:在中低分化組Treg細(xì)胞數(shù)（25.8±6.5）明顯高于高分化組（18.2±4.3）,P＜0.01;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Treg細(xì)胞數(shù)（24.4±6.4）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（18.9±7.5）,P＜0.05;無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組Treg細(xì)胞數(shù)（21.5±7.3）明顯高于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（11.2±1.9）,P＜0.05。但與腫瘤浸潤深度和臨床分期相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表1 42例CRC患者臨床病理特征Tab.1 Clinical characteristics of patients whose tumors were used in the tissue assay

表2 CRC組織和癌旁組織FOXP3表達(dá)水平比較Tab.2 Median density of the T-cellmakers FOXP3+in colorectal tumor tissues and peri-cancer tissue

圖1 免疫組化檢測 FOXP3+Tregs和FOXP3+ICOS+Treg在組織中表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical staining showing the expression of FOXP3+Treg and FOXP3+ICOS+Treg in CRC tissues

表3 CRC組織FOXP3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.3 FOXP3 expression and relationship with clinical pathological parameters

2.4 CRC組織中Treg亞型的表達(dá) 本實驗采用雙重免疫組化法檢測CRC組織中表達(dá)Treg亞型表達(dá)情況。FOXP3+ICOS+Treg細(xì)胞表現(xiàn)為黑色顆粒定位于細(xì)胞核（FOXP3+）,紅色顆粒定位于細(xì)胞膜（ICOS+）。結(jié)果:42例CRC組織中有34例可見到FOXP3+ICOS+Treg陽性細(xì)胞的表達(dá),陽性率為81%;10例表達(dá)FOXP3+癌旁組織中,僅有1例可見到ICOS分子的弱表達(dá),陽性率為10%,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著（P＜0.01）,（圖1）。

3 討論

腫瘤通過各種直接或間接的機制來逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。一系列的研究已經(jīng)證明,Treg細(xì)胞與腫瘤免疫逃避機制密切相關(guān)。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中,存在Treg比例增高現(xiàn)象[6-9]。Treg通過細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸或通過細(xì)胞因子的釋放,對效應(yīng)性CD4+/CD8+T細(xì)胞活化和增殖發(fā)揮抑制作用。其效應(yīng)機制主要是抑制CD4+T細(xì)胞增生、抑制腫瘤特異性抗原激活的CD4+效應(yīng)細(xì)胞分泌 IL-2[10,11],抑制CD8+IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生,并在腫瘤微環(huán)境中能限制CTLs（Cytotoxic T lymphocytes）細(xì)胞毒性顆粒釋放,使腫瘤細(xì)胞逃逸免疫殺傷[12,13]。

因此,在以細(xì)胞免疫為主的腫瘤免疫過程中,Treg處于關(guān)鍵環(huán)節(jié),在機體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用,決定了免疫反應(yīng)的最終走向是激活免疫還是誘導(dǎo)耐受。本實驗研究CRC患者腫瘤組織內(nèi)浸潤的Treg細(xì)胞分布情況,發(fā)現(xiàn)CRC患者組織內(nèi)Treg數(shù)量顯著高于癌旁對照組。對Treg細(xì)胞與臨床病理參數(shù)關(guān)系進行分析后發(fā)現(xiàn):中-低分化患者癌組織中Treg數(shù)量顯著高于高分化者,腫瘤分化程度越低Treg數(shù)量越多,惡性程度越高。這些結(jié)果提示Treg在CRC腫瘤免疫中扮演重要角色,Treg可能影響了腫瘤的分化,促進了腫瘤進展。Woo等[6]首先報道了Treg表達(dá)與腫瘤侵犯局部淋巴細(xì)胞有關(guān)。本實驗也發(fā)現(xiàn),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者癌組織中Treg數(shù)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示隨著腫瘤細(xì)胞浸潤到局部淋巴結(jié),Treg介導(dǎo)的免疫抑制有增強趨勢。另外,本實驗還顯示一個值得注意的現(xiàn)象,Treg在局限性腫瘤的浸潤者TIL表達(dá)顯著高于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。提示Treg在惡性腫瘤中的浸潤可能是一個動態(tài)過程,作為局限性腫瘤的最初反應(yīng),Treg數(shù)量增加,而腫瘤轉(zhuǎn)移擴散后Treg的數(shù)量相對減少。

根據(jù) ICOS分子的表達(dá),將其分成FOXP3+ICOS+Treg和 FOXP3+ICOS-Treg兩組細(xì)胞。FOXP3+ICOS+Treg細(xì)胞通過IL-10、TGF-β抑制CD4+T細(xì)胞增殖,而 FOXP3+ICOS-Treg細(xì)胞僅通過 TGF-β來發(fā)揮功能[4]。在人前列腺癌、黑色素瘤研究中發(fā)現(xiàn),TIL（Tumor-infiltrating lymphocytes,TIL）中多為FOXP3+ICOShighTreg細(xì)胞群,而患者外周血及正常人群外周血以FOXP3+ICOSlowTreg細(xì)胞群為主。FOXP3+ICOShighTreg細(xì)胞比FOXP3+ICOSlow細(xì)胞對效應(yīng)T細(xì)胞有著更強的抑制作用。同時,這群細(xì)胞還高表達(dá)Fas、FasL和Granzyme B,可能對Treg誘導(dǎo)CD4+和 CD8+細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[14,15]。目前在CRC組織中是否存在FOXP3+ICOS+Treg和FOXP3+ICOS-Treg兩種細(xì)胞亞群尚不明確。本實驗采用雙重酶標(biāo)免疫組化技術(shù)同時檢測CRC組織中FOXP3和 ICOS表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXP3+ICOS+Treg在CRC組織中的表達(dá)率明顯高于癌旁組織中的表達(dá)率。提示表達(dá)ICOS分子的Treg可能具有更強的免疫抑制功能。我們將在今后實驗中,進一步深入研究FOXP3+ICOS+Treg詳細(xì)分子作用機制。

以上結(jié)果顯示CRC的發(fā)生發(fā)展與其癌組織局部微環(huán)境中Treg數(shù)量變化有直接關(guān)系,ICOS的表達(dá)可能在調(diào)解Treg功能方面起重要作用,CRC患者的腫瘤微環(huán)境可能通過某種機制促進了Treg的分化或增殖。

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[收稿2009-06-20 修回2009-07-30]

（編輯 倪 鵬）

Distribution of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells and their subsets in colorectal carcinoma and the clinical significance

GAIXiao-Dong,ZHAOLi-Wei,LIChun.SchoolofBasicMedicalSciences,BeihuaUniversity,Jilin132013,China

Objective:To determine the distributionof CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells（Treg）and Treg subsets in human colorectal carcinomamicroenvironment and to exp lore their correlation with conventional clinico-pathological features.Methods:Frozen sections and Immunohistochemistry（IHC）were used to detect FOXP3+Treg in fresh specimen collected from 42 patientswith colorectal carcinoma.The number of FOXP3+Tregwas evaluated in terms of its association with clinico-pathologicalfeature in tumor and peri-cancer tissue.Double staining was performed to determ ine the expression of ICOS and FOXP3.Results:The numberof FOXP3+Treg in the colorectal carcinoma（mean 24.1）was significantly higher than that in peri-cancer tissue（mean 0.7）.A highernumber of tumor infiltrating FOXP3+Tregswas found in the patientgroupswith poordifferentiation,lymphaticmetastasis and non-distantmetastasis as com pared to the patientgroupswithwell differentiation,non-lymphaticmetastasis and distantmetastasis.The percentage of FOXP3+ICOS+Tregwas higher in colorectal carcinoma（81%）than that in peri-cancer tissue（10%）.Conclusion:Increased FOXP3+Tregmay influence theoccurrence and developmentof colorectal carcinoma.Our data support the hypothesis that tumor infiltrating FOXP3+Tregs attenuate the immune response against cancerand suggest that strategy to overcome FOXP3+Treg functionmay be beneficial in the treatmentof human colorectal cancer.

Colorectal carcinoma;Treg;FOXP3;ICOS

R730.3

A

1000-484X（2010）01-0075-04

①本文受吉林省教育廳項目（吉教科合字[2008]第128號）資助

蓋曉東（1962年-）,女,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤免疫學(xué)研究及腫瘤分子病理學(xué)研究,E-mail:gaixiaodong@yahoo.com.cn。