應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌差異表達(dá)基因消減cDNA文庫①

劉艷群 杜先智 (重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶400010)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌差異表達(dá)基因消減cDNA文庫①

劉艷群 杜先智 (重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶400010)

目的:構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌H37Rv與H37Ra的差異表達(dá)基因消減文庫,分離結(jié)核分枝桿菌差異表達(dá)cDNA片段。方法:利用抑制性消減雜交技術(shù)分析結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因組mRNA的表達(dá)差異,并進(jìn)行兩輪消減雜交和兩次PCR,將第二次PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體相連,電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E.coli DH5α進(jìn)行文庫擴(kuò)增和藍(lán)白斑篩選,RTPCR鑒定差異表達(dá)文庫。結(jié)果:以結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv的cDNA為檢測(cè)子的正相雜交和以弱毒株H37Ra的cDNA為檢測(cè)子的反相雜交各自高表達(dá)或特異性表達(dá)的片段都得到選擇性擴(kuò)增,成功構(gòu)建了差異表達(dá)cDNA文庫A庫和B庫。所長(zhǎng)出的菌落中90%為白色克隆,其中單一條帶的克隆占75%和80%,片段大小集中在100～800 bp之間。結(jié)論:利用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差異表達(dá)基因消減cDNA文庫,該消減文庫的建立為進(jìn)一步篩選、克隆這兩種菌株之間差異表達(dá)的新基因奠定了基礎(chǔ)。

分枝桿菌,結(jié)核;抑制性消減雜交;cDNA文庫

抑制消減雜交(Suppression subtractive hybridization,SSH)是20世紀(jì)90年代末出現(xiàn)的一種新的篩選差異表達(dá)基因技術(shù),此技術(shù)應(yīng)用兩次消減雜交和兩次抑制性PCR,在消減雜交過程中使豐度不同的cDNA拷貝數(shù)趨于平衡,靈敏度提高,保證了較低豐度的差異表達(dá)基因也得到有效的克隆,與其它差異基因分離方法相比表現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)越性[1]。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是肺結(jié)核的病原菌,盡管目前有可以選擇的治療方法,但是每年仍然有兩百萬人死于肺結(jié)核。目前大約有三分之一的人感染了MTB,每年有七百萬到八百萬新發(fā)肺結(jié)核病例[2]。通過比較基因組之間的差異,探索結(jié)核分枝桿菌的致病分子機(jī)理、篩選結(jié)核致病菌的毒力基因、尋找及鑒定結(jié)核分枝桿菌毒力基因成為研究熱點(diǎn)[3]。本研究選擇結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra為SSH的研究對(duì)象,成功構(gòu)建了這兩種菌株之間差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫,為進(jìn)一步篩選、克隆其差異表達(dá)的新基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv(ATCC27294)由重慶市結(jié)核基因診斷中心實(shí)驗(yàn)室提供,弱毒株H37Ra(ATCC25177)由重慶醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供。pGEM-T載體(Promega公司)用于DNA片段的克隆及其上的插入片段的分析。E.coli DH5α(上海迪奧生物科技有限公司)用于載體的克隆。米氏7H9液體培養(yǎng)基(法國(guó)梅里埃公司)用于分枝桿菌的培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 PCR-selectTMcDNA subtraction kit購(gòu)自日本Clontecth公司,Trizol RNA提取試劑和SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司,T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、RsaⅠ、pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司,PCR Product Purification K it、Taq DNA polymerase、溶菌酶、蛋白酶K、DNA marker DL2500均購(gòu)自日本TaKaRa公司產(chǎn)品,引物的合成、dNTP均由上海迪奧生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 分枝桿菌接種于米氏7H9液體培養(yǎng)基,在生物安全柜中操作,按法國(guó)梅里埃公司米氏7H9培養(yǎng)基要求說明,將接種后的培養(yǎng)瓶置于法國(guó)梅里埃公司BacTALERT○RMP處理系統(tǒng)進(jìn)行快速液體培養(yǎng),37℃,約2～3周,每周觀察一次。H37Rv與H37Ra各10瓶,每瓶10 ml,同時(shí)封口,標(biāo)記。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌RNA抽提及純化 按無菌操作原則,取上述菌液各100 ml,高速離心至結(jié)核分枝桿菌完全沉淀。去除上清,再離心一次,用加樣槍吸取上清。沉淀收集后分別加入1 ml Trizol(按試劑盒說明書操作),室溫靜置10～15分鐘,充分裂解細(xì)胞。加200μl氯仿,充分混勻,15 000 r/min離心5～7分鐘。取上清,至1.5 ml EP管加500μl異丙醇,混勻,15 000 r/min離心10分鐘。棄上清,用1 ml 75%乙醇沖洗,高速離心5分鐘。棄上清,RNA沉淀于空氣中干燥2～3分鐘,將干燥后的RNA溶解于DEPC水中,分別提取H37Rv和H37Ra的總RNA。經(jīng)DNA酶處理后稀釋400倍做紫外分析測(cè)定,并取少量做凝膠電泳檢測(cè)鑒定。按TaKaRa公司PCR Product Purification K it操作說明,對(duì)檢測(cè)符合要求的各管進(jìn)行RNA純化。

1.2.3 抑制性消減雜交 通過mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA用RsaⅠ四堿基限制性內(nèi)切酶消化為0.1～1 kb的片段,接頭連接,進(jìn)行消減雜交:以 H37Rv cDNA為檢測(cè)子,H37Ra cDNA為驅(qū)動(dòng)子的為正相雜交;以H37Ra cDNA為檢測(cè)子,H37Rv cDNA為驅(qū)動(dòng)子的為反相雜交。采用Clontech公司的PCR-selectTMcDNA subtraction kit進(jìn)行抑制消減雜交,原理詳見[3,4]。具體按說明書進(jìn)行操作并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。進(jìn)行兩次雜交及兩次選擇性的PCR擴(kuò)增。

1.2.4 cDNA消減文庫的構(gòu)建 正反兩相消減雜交第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,分別取3μl經(jīng)T4 DNA連接酶與pGEM-T載體(Promega公司)16℃連接過夜,乙醇沉淀濃縮成4μl,電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5α中,冰浴30分鐘,42℃1.5分鐘,重置于冰上2分鐘,加入500μl SOC培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將含100μl/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基使用前涂10μl濃度為100 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和20μl濃度為50 mg/ml的XGal,作為藍(lán)白斑篩選平板。離心轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,取沉淀涂于藍(lán)白斑篩選平板,37℃過夜,構(gòu)建正相和反相消減文庫A庫和B庫。

1.2.5 消減文庫的擴(kuò)增及鑒定 隨機(jī)挑取A庫和B庫白色菌落100個(gè),接種于含100μl/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基,37℃輕搖過夜,各取1μl菌液作為RT-PCR模版進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。以Nest primer 1R及Nest primer 2R作為引物,PCR擴(kuò)增插入片段。20 μl的反應(yīng)體系:模板1μl、Nest primer 1R(10μmol/L) 1μl、Nest primer 2R(10μmol/L)1μl、dNTP(25 mmol/L each)2μl、10×PCR buffer 2μl、Taq酶0.2 μl,補(bǔ)H2O至總體積20μl。反應(yīng)程序:95℃5分鐘, 94℃15秒,65℃30秒,72℃90秒,72℃10分鐘后保存在4℃。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌RNA抽提結(jié)果 紫外分光檢測(cè)RNA核酸260 nm和280 nm處的吸收值,測(cè)得國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv株的基因組OD260/OD280比值和弱毒株 H37Ra基因組OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間,可以認(rèn)為樣品較純,沒有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染。1.5%瓊脂糖凝膠電泳可清晰看見RNA條帶清晰明亮,無彌散拖尾現(xiàn)象,見圖1。

2.2 消減雜交結(jié)果分析 H37Rv和H37Ra RNA通過mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA經(jīng)RsaⅠ四堿基限制性內(nèi)切酶消化為0.1～1 kb的片段,然后進(jìn)行消減雜交:以H37Rv cDNA為檢測(cè)子,H37Ra cDNA為驅(qū)動(dòng)子的為正相雜交;以H37Ra cDNA為檢測(cè)子, H37Rv cDNA為驅(qū)動(dòng)子的為反相雜交,進(jìn)行兩輪雜交和兩次PCR擴(kuò)增。

圖2為正、反相消減雜交第一次PCR擴(kuò)增結(jié)果,1泳道為正相消減雜交第一次PCR擴(kuò)增結(jié)果,2泳道為反相消減雜交第一次PCR擴(kuò)增結(jié)果。從圖中可以看出正反兩相消減雜交第一次PCR擴(kuò)增的電泳帶較弱,僅在100～400 bp之間看見較弱的條帶。圖3為正反相消減雜交第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果, 1泳道為正相消減雜交第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果,2泳道為反相消減雜交第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果。從圖中可以看出經(jīng)過兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR,正反兩相消減雜交Tester中的差異表達(dá)基因都得到有效的富集和擴(kuò)增,可以看見明顯的電泳條帶,位于100～800 bp之間,說明消減雜交是成功的。

2.3 SSH文庫的構(gòu)建 正反兩相消減雜交第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,經(jīng)T4 DNA連接酶與pGEM-T載體連接,電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5α中構(gòu)建質(zhì)粒載體文庫A庫和B庫。平皿上可見藍(lán)白分明的菌落(圖4)。所長(zhǎng)出的菌落中,90%為白色菌落。剩余菌液加甘油,液氮速凍后,-70℃保存。

圖1 抽提RNA結(jié)果Fig.1 The result of RNA abstraction

圖2 消減雜交后第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析Fig.2 The first PCR products of subtractive hybridization

圖3 消減雜交后第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析Fig.3 The second PCR products of subtractive hybridization

圖4 SSH文庫轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.4 Transformation result of SSHLibrary

圖5 A庫部分克隆PCR鑒定(從左至右為A1-24白色克隆)Fig.5 Identification of some recombinants in the correctitude subtractive hybridization Library by using PCR

圖6 B庫部分克隆PCR鑒定(從左至右為B1-24白色克隆)Fig.6 Identification of some recombinants in the reverse subtractive hybridization Library by using PCR

2.4 陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果 消減產(chǎn)物克隆到T-easy載體上,所長(zhǎng)出菌落中90%為白色克隆。對(duì)所有白色克隆用Nested primer 1R和Nested primer 2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后分析均有條帶在100～800 bp之間呈隨機(jī)分布。

圖5、6分別顯示了A庫和B庫的24個(gè)克隆的PCR擴(kuò)增的情況。圖5為正相消減雜交文庫A庫中隨機(jī)挑取的白色菌落的PCR擴(kuò)增情況,所挑取的24個(gè)白色克隆75%為單一條帶。同樣,圖6為反相消減雜交文庫B庫的PCR擴(kuò)增情況,80%為單一條帶,說明這些克隆中均可能含有結(jié)核分枝桿菌H37Rv和 H37Ra各自獨(dú)有的特異性表達(dá)的cDNA片段。

3 討論

近幾年,隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn),涌現(xiàn)了許多基于PCR的分離有差別表達(dá)基因的新方法。如mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription PCR或DD)、代表性差示分析技術(shù)(representational difference analysis,RDA)、交互差減RNA差別顯示技術(shù)(reciprocal subtraction differential RNA display,RSDD)及SSH技術(shù)。SSH是Diatchenko等[4]于 1996年依據(jù)消減雜交和抑制性PCR發(fā)展起來的一種分離差異表達(dá)基因的方法。該方法最早應(yīng)用于真核生物mRNA差異表達(dá)基因的研究中。1998年應(yīng)用于原核生物基因組差異比較的研究中。因其具有操作簡(jiǎn)單且篩選效率高等優(yōu)點(diǎn),Akopyants等[5]首次將該方法進(jìn)行改良并用于細(xì)菌基因組比較分析。目前已成功地運(yùn)用到豬鏈球菌毒力株與無毒株[6]、大腸桿菌與沙門桿菌[7]等微生物基因組的差異基因表達(dá)分析中,并獲得了多種細(xì)菌的毒力基因及致病相關(guān)基因。證明SSH為分離差異表達(dá)基因的有效方法,為病原體中未知的毒力基因(致病島)篩選和微生物基因組差異、分子進(jìn)化的研究提供了重要技術(shù)手段。

結(jié)核分枝桿菌毒力基因的尋找與鑒定是結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制研究的重點(diǎn)。通過SSH構(gòu)建結(jié)核菌株之間的差異表達(dá)基因文庫可以為上述研究奠定基礎(chǔ)。并且利用SSH構(gòu)建的消減文庫具有突出的優(yōu)點(diǎn):該技術(shù)經(jīng)過兩輪消減雜交及兩次抑制性PCR,使Tester中代表差異表達(dá)基因的cDNA片段得到大量擴(kuò)增,同時(shí)抑制了非特異性cDNA片段的擴(kuò)增,使各種消減文庫的特異性得到極大的提高。且在進(jìn)行陽性克隆篩選時(shí)可結(jié)合高通量的篩選方法如基因芯片、高密度點(diǎn)陣膜等。Mahairas等[8]以BCG基因組片段與H37Rv基因組酶切產(chǎn)物進(jìn)行消減雜交,發(fā)現(xiàn)BCG中缺少3個(gè)獨(dú)立基因區(qū)RD1、RD2、RD3,認(rèn)為這些基因的缺失導(dǎo)致BCG毒力的減弱。Brosch等[9]先分析了H37Rv和H37Ra基因組酶切產(chǎn)物多態(tài)性的不同,再選擇了有差異的酶切片段標(biāo)記探針,并與兩者基因組酶切產(chǎn)物雜交,發(fā)現(xiàn)在H37Rv的基因Rv1755c中IS6110插入序列的插入位置與H37Ra的不同,并證實(shí)在H37Ra基因組中也有類似BCG中RD2區(qū)域的存在。

我們以結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和H37Ra為研究對(duì)象,以H37Rv cDNA為檢測(cè)子,H37Ra cDNA為驅(qū)動(dòng)子的為正相雜交;以H37Ra cDNA為檢測(cè)子, H37Rv cDNA為驅(qū)動(dòng)子的為反相雜交,進(jìn)行兩輪消減雜交和兩次抑制性PCR,使Tester與Driver中共有基因的cDNA片段得到有效消減,而存在于Tester中的特異性表達(dá)基因得到特異性擴(kuò)增。利用T/A克隆技術(shù),將特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α中,成功構(gòu)建了正相消減文庫A庫和反相消減文庫B庫。文庫經(jīng)擴(kuò)增后,經(jīng)藍(lán)白斑初步篩選,隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行繁殖。菌液經(jīng)RT-PCR鑒定,結(jié)果顯示A庫75%的克隆為單一條帶,為100～800 bp之間的插入片段,B庫80%的克隆為單一的條帶,為100～600 bp之間的插入片段,說明這些克隆中均可能含有結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra各自獨(dú)有的特異性表達(dá)的cDNA片段。我們已經(jīng)從A庫和B庫中各自篩選出一批克隆,目前正在測(cè)序。在下一步的實(shí)驗(yàn)中,我們將對(duì)篩選出來的克隆進(jìn)行特異性鑒定及功能分析,以明確所篩選的特異性片段的功能及表達(dá)特征,希望找出強(qiáng)毒株H37Rv獨(dú)有的且以前未曾發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性抗原,以期構(gòu)建新型結(jié)核粘膜疫苗。結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra基因消減文庫的構(gòu)建,不僅大大減少了用Northern雜交、RT-PCR等技術(shù)進(jìn)一步篩選、鑒定其特異性基因的盲目性,提高了特異性,而且為揭示結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理、毒力基因?qū)ふ壹盎蛟\斷、基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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3 Huang XW,Li YX,Niu Q Het al.Suppression subtractive Hybridization (SSH)and its modifications in microbiological research[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007;76(4):753-760.

4 Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A Pet al.Suppression subtraction hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996;93: 6025-6030.

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[收稿2009-07-25 修回2009-07-29]

(編輯 倪 鵬)

Construction of subtracted cDNA library by suppression subtracted hybridization for differentially expressed genes in Mycobacterium tuberculosis

LIU Yan-Qun,DU Xian-Zhi.Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400010,China

Objective:T o isolate Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra genes especially,and to construct two cDNA libraries by using suppression subtractive hybridization(SSH).Methods:We used suppression subtractive hybridization(SSH)to clone the differential genomic genes between Mycobacterium tuberculosis virulence strain H37Rv and attenuated strain H37Ra.After two times of subtractive hybridization and two times of PCR,the products of last PCR amplification were inserted into pGEM-T Easy vector and be transformed into the E.coli DH5αand screened of blue and white clones of the transformants.The subtracted cDNA library of differentially expressed genes were identified by RT-PCR.Results:High or especially expressed genes as tester had been obtained by SSH in correctitude reaction(H37Rv as tester)and reverse reaction(H37Ra as tester),the cDNA librariesof A and B of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra were successfully constructed.90%of the colonies were white clones,the single band of the colonies was 75%and 80%.Conclusion:The cDNA libraries of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra were successfully constructed using SSH technique,which lay a solidfoundationfor screening and cloning new specific differentially expressed genes in them.

Mycobacterium tuberculosis;Suppression subtractive hybridization;cDNA library

R328 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)01-0061-05

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30872261)

劉艷群(1974年-),女,碩士,主要從事結(jié)核與免疫方面研究;

及指導(dǎo)教師:杜先智(1964年-),男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事結(jié)核病防治方面的研究,E-mail:dxzdjy868@sina.com。