人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的研究①

馮海燕 劉瑞風(fēng) 張開(kāi)明 （山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,太原 030000）

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的研究①

馮海燕 劉瑞風(fēng)②張開(kāi)明②（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,太原 030000）

目的:研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的體外分離培養(yǎng)方法及在特定微環(huán)境下分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的潛能,可能為銀屑病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）,體外擴(kuò)增培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定。加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）定向誘導(dǎo)hMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定,Dil-ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。結(jié)果:經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定分離培養(yǎng)的hMSCs CD71、CD44 陽(yáng)性表達(dá),CD54、CD106、CD45 弱陽(yáng)性表達(dá),CD34、CD31、VWF、KDR、HLA-DR 陰性表達(dá);經(jīng) bFGF 、VEGF 誘導(dǎo)后的 hMSCs可見(jiàn)類似內(nèi)皮細(xì)胞樣改變,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),與對(duì)照組相比內(nèi)皮細(xì)胞特異表面標(biāo)志 CD34、CD31、VWF、KDR表達(dá)轉(zhuǎn)為陽(yáng)性（P＜0.01）,而HLA-DR、CD54、CD106、CD45表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）;誘導(dǎo)分化后的內(nèi)皮樣細(xì)胞具有攝取 Dil-ac-LDL的能力。結(jié)論:密度梯度離心法結(jié)合貼壁法可獲得較純的MSCs;在bFGF、VEGF誘導(dǎo)作用下,hMSCs具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能,產(chǎn)生功能性內(nèi)皮細(xì)胞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;血管內(nèi)皮細(xì)胞;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow stem cells,MSCs）是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的另一類干細(xì)胞類型,具有自我更新和多向分化潛能,已證實(shí)這類細(xì)胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細(xì)胞分化[1-4]。目前國(guó)內(nèi)外研究初步表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的理想的種子細(xì)胞[5]。由于我們前期工作發(fā)現(xiàn)銀屑病患者骨髓造血干細(xì)胞以及造血微環(huán)境存在異常。因此,我們推測(cè)與造血干細(xì)胞同源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能也存在異常,且由其體外分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞可能也具有銀屑病的發(fā)病特點(diǎn)。本研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)成人MSCs,并將其體外定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞,使所得細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞特性,為銀屑病研究提供新的平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清（杭州四季青）、DMEM-F12培養(yǎng)基（Hyclon）、人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)?yáng)）、青霉素鏈霉素混合液（華北制藥廠）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF,Sigma公司,美國(guó)）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF,Sigma公司,美國(guó)）、CD44-FITC（BD公司,美國(guó)）、藻紅素標(biāo)記的CD34（CD34-phycoerythrin,CD34-PE）（BD公司,美國(guó)）、CD71-FITC（BD公司,美國(guó)）、藻紅素標(biāo)記的CD31（CD31-phycoerythrin,CD31-PE）（PharM ingen）、CD45-PE（BD公司,美國(guó)）、異硫氫酸熒光素標(biāo)記的CD106-FITC（BD公司,美國(guó)）、HLA-DR-FITC（BD公司,美國(guó)）、鼠抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelialgrowth factor receptor-2,VEGFR-2/KDR）（Invitrogen）單克隆抗體、鼠抗血管性假血友病因子（VonWillebrand Factor,VWF）（Invitrogen）單克隆抗體、鼠抗CD54單克隆抗體（Invitrogen）、FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（Maxin）;DiI-ac-LDL（Invitrogen）;倒置相差顯微鏡（Olympus公司,日本）、37℃恒溫培養(yǎng)箱（Sheldon Manufacturing Inc）、流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur型 ,美國(guó)）。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 骨髓來(lái)自血液科健康志愿捐獻(xiàn)成人共5m l,肝素抗凝,用DMEM/F12培養(yǎng)液1∶1稀釋后加于人淋巴細(xì)胞分離液上部,比例為3∶1,操作時(shí)將骨髓小心貼壁滴下,避免與人淋巴細(xì)胞分離液混合。2 000 r/min離心20分鐘,吸取云霧狀的白膜層即單個(gè)核細(xì)胞層,用DMEM/F12懸浮后,以1 000 r/m in離心10分鐘,吸棄上清,重復(fù)洗滌細(xì)胞二次,之后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12,以及青霉素（100 U/ml）鏈霉素（100μg/ml）混合液重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×106m l-1密度接種于24孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 hMSCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增 細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,全量換培養(yǎng)液,連同未貼壁的細(xì)胞棄去,加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM-F12,繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,以后每3天半量換液一次,倒置相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后即伸展,呈長(zhǎng)梭形或多角形,并開(kāi)始呈克隆樣生長(zhǎng),此即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。生長(zhǎng)14天左右近80%融合時(shí),吸取培養(yǎng)液,用PBS液沖洗一次,去除殘余的血清培養(yǎng)液,以免影響胰蛋白酶活性。然后每孔加入200μl含0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化液消化3分鐘左右,倒置相差顯微鏡下觀察,待細(xì)胞變圓部分脫落后,加入含血清的培養(yǎng)液中終止消化,并輕輕吹打,以1 000 r/min離心5分鐘去消化液,加10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液重懸,接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),為第一代細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。按上述方法以1∶2繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)。

1.4 人MSCs表面標(biāo)志鑒定 用FITC或PE標(biāo)記的表面分子CD34、CD44、CD71抗體對(duì)第三代MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.5 誘導(dǎo)分化 MSCs細(xì)胞傳至第三代時(shí),分兩組即對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑,每三天半量換液;實(shí)驗(yàn)組加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo),即加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）10 ng/ml,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）20 ng/m l,2%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液,向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化。每三天半量換液,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 誘導(dǎo)0、14、24天分析細(xì)胞的表型 CD54、CD34、CD31、KDR、VWF、HLA-DR、FLT-l的表達(dá)。每個(gè)培養(yǎng)孔加入200μl0.02%EDTA消化,用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng),吸管仔細(xì)吹打,離心后去上清,PBS洗滌1遍,用PBS制成懸液每份1×105個(gè)細(xì)胞調(diào)整到100μl,用直接熒光標(biāo)記的抗體時(shí),按說(shuō)明細(xì)胞懸液中直接加抗體后冰上避光孵育60分鐘,以1 300 r/min離心4分鐘棄含熒光標(biāo)記抗體的PBS,再用PBS洗滌一次,以去除未結(jié)合的熒光抗體,降低背景干擾,100μl Buffer重新懸浮細(xì)胞,在4℃下保存待測(cè);用間接熒光標(biāo)記的抗體時(shí),首先加1μl一抗,冰上孵育60分鐘,用PBS液洗一遍,再加1μl二抗（FITC標(biāo)記）,避光冰上孵育40分鐘,PBS液洗一遍,100μl Buffer重新懸浮細(xì)胞,在4℃下保存待測(cè)。

1.7 DiI熒光標(biāo)記法 誘導(dǎo)后的細(xì)胞吸棄培養(yǎng)液,PBS洗滌2遍。將熒光活性染料DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-acetylated low density lipoprotein,DiI-ac-LDL）4μg（用培養(yǎng)液稀釋）加入培養(yǎng)皿,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí),吸棄含DiI-ac-LDL的培養(yǎng)液,PBS洗3次,換新鮮培養(yǎng)液,加入30 μl UEA,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)吸棄培養(yǎng)液,PBS洗3次,流水沖去PBS,吹干后標(biāo)本上滴加緩沖甘油,熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后hMSCs的DiI-ac-LDL攝取能力,并拍片。

2 結(jié)果

2.1 hMSCs體外分離培養(yǎng)和鑒定 形態(tài)學(xué)觀察:相差顯微鏡下,hMSCs接種2天首次換液可見(jiàn)少量梭形或多角形貼壁細(xì)胞,形態(tài)類似成纖維細(xì)胞 （圖1A）。7天后細(xì)胞迅速增殖;10天左右可見(jiàn)典型的克隆集落,中心細(xì)胞為近圓形,密集生長(zhǎng),外周細(xì)胞為長(zhǎng)梭形纖維樣細(xì)胞,呈魚(yú)群狀排列,相互融合連接成片;14天左右局部細(xì)胞匯合可達(dá)80%～90%,匯合細(xì)胞形態(tài)均一,呈梭形平行排列（圖1B）。傳代的細(xì)胞增殖迅速,7天左右就可以基本融合,傳三代的MSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定hMSCs表面標(biāo)志CD106、CD44、CD71、CD54 陽(yáng)性表達(dá)分別為 6.51%、89%,65.3%,10.6%（圖 3-1）,而 CD34、CD31、VWF 、KDR、HLA-DR 、CD45陰性表達(dá)。

2.2 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)改變 細(xì)胞誘導(dǎo)分化后光鏡下形態(tài)誘導(dǎo)后2天,細(xì)胞由原來(lái)的長(zhǎng)梭形變短、變粗,成多角形,細(xì)胞聚集形成放射狀集落（圖2A）;繼而細(xì)胞伸出偽足相互連接,成管網(wǎng)狀排列,并形成血管腔樣結(jié)構(gòu)（圖2B）;誘導(dǎo)后14～21天,血管腔樣結(jié)構(gòu)密度增加。管腔直徑變得寬大,管腔樣結(jié)構(gòu)周圍有呈鋪路石樣排列的內(nèi)皮樣細(xì)胞（圖2C）。對(duì)照細(xì)胞組光鏡下觀察形態(tài)無(wú)改變。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)情況（×100）Fig.1 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells（×100）

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞Fig.2 Differentiation of MSCs into endothelial-like cells in vitro

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hMSCS表面標(biāo)志Fig.3 hMSC sur facemarkers detected by flow cytometry

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)14天,24天內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志KDR、CD54、CD31、HLA-DR、CD106、CD34、VWF、CD45表達(dá)比較圖Fig4 FACS ana lysis of exp ression of CD34,CD54,CD31,HLA-DR,KDR,CD106,VW F and CD45 in induced MSCs

表1 人MSCs誘導(dǎo)14天與24天血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表型的表達(dá)Tab.1 Expression of specific surfacemarkers of vascular endothelial cells after induced 14 d and 24 d

圖5 熒光顯微鏡觀察誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞對(duì) Dil-ac-LDL攝取能力疊加圖（×100）Fig.5 Differentiated endothelial like-cellsw ere double-positive stained with uptake of DiI-ac-LDL and binding of UEA

2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞表面抗原分析 誘導(dǎo)分化后14、24天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性表型CD34、CD31、VWF、KDR,內(nèi)皮細(xì)胞非特異表型 CD54、CD45、HLADR、CD106表達(dá)量與0天相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后14天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD31、VWF、KDR呈陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≤0.01）,誘導(dǎo) 24天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34、CD31、VWF與 14天相比表達(dá)量明顯上升,差異具有顯著性,但KDR表達(dá)雖有上升,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1,圖4）,內(nèi)皮細(xì)胞非特異表型CD54、CD45、HLA-DR、CD106表達(dá)量與14天相比表達(dá)量明顯上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≤0.01）。

2.4 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞Dil-ac-LDL攝取能力 在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后第24天進(jìn)行Dil-ac-LDL攝取試驗(yàn),并用DAPI細(xì)胞核染色,DiI熒光標(biāo)記法結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化后的內(nèi)皮樣細(xì)胞具有攝取Dil-ac-LDL的能力（圖5）。

3 討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)理的研究一直是國(guó)內(nèi)外皮膚科學(xué)界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),雖然眾多學(xué)者從遺傳、免疫、感染以及環(huán)境因素等多方面進(jìn)行了大量的研究,但至今仍未獲得滿意的解釋。在上述多種可能的致病因素中,目前受到普遍關(guān)注的是遺傳因素和免疫功能紊亂。但是,無(wú)論由何種致病因素引起,表皮改變是銀屑病諸多異常的結(jié)果,也是本病特殊的臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ),其中真皮乳頭微血管增生、擴(kuò)張、通透性增加又是本病表皮改變的始動(dòng)因素。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞,在體內(nèi)或體外特殊條件下可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源。由于我們前期工作發(fā)現(xiàn)銀屑病患者骨髓造血干細(xì)胞有異常[6,7],初步研究表明銀屑病患者造血微環(huán)境、造血干細(xì)胞及造血干細(xì)胞分化的T細(xì)胞有異常[8,9],提示造血干細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中有重要的意義。因此,我們推測(cè)與造血干細(xì)胞同源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能也存在異常,由其體外分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞可能也具有銀屑病的發(fā)病特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬將銀屑病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞分選或免疫磁珠分離法進(jìn)行分離。密度梯度離心法因其簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì),效果較好而被廣為應(yīng)用。我們采用1.077 g/m l的Ficoll進(jìn)行分離,并通過(guò)換液逐步去除不貼壁的紅細(xì)胞和白細(xì)胞等;利用貼壁細(xì)胞粘附能力不同,間充質(zhì)干細(xì)胞傳代時(shí)所需消化時(shí)間較短的特點(diǎn),去除貼壁較為牢固的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,使間充質(zhì)干細(xì)胞得以純化。目前間充質(zhì)干細(xì)胞尚未發(fā)現(xiàn)有特異性的表面標(biāo)記物。各實(shí)驗(yàn)室報(bào)道均有差異,一般認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)多種表面標(biāo)記物,包括細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子及其受體等,但不表達(dá)血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的抗原。我們經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD44、CD71,但不表達(dá)造血細(xì)胞系特有的 CD34、CD31、VWF、KDR、HLADR。證明經(jīng)上述方法可以獲得較純的MSCS。

MSCs的分化機(jī)制和誘導(dǎo)條件目前尚未闡明。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為,MSCs的分化方向與微環(huán)境“壁龕”（niche）密切相關(guān)?！氨邶悺钡慕M織成分相當(dāng)復(fù)雜,不同組織的細(xì)胞微環(huán)境有著各不相同的因子?？赡苓@就是誘導(dǎo)進(jìn)入不同組織的MSCs獲得靶組織的表型、向不同細(xì)胞譜系分化的主要原因之一。如果將MSCs處于向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的微環(huán)境中,MSCs的某些特征性血管內(nèi)皮細(xì)胞基因?qū)㈤_(kāi)放,并可能表達(dá)相關(guān)蛋白,從而使其直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF是間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的重要條件,可以促進(jìn)BMSCs分化的同時(shí)上調(diào)KDR和FLT-l的表達(dá),而這兩種因子在體內(nèi)血管再生以及體外促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,FLT-1、KDR是內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的早期表面受體,主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的早期。Ⅷ能與血管性假血友病因子（VonWillebrand Factor,VWF）結(jié)合形成復(fù)合物,存在于循環(huán)血液中。VWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,在血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)有這種復(fù)合物存在。Ⅷ因子相關(guān)抗原是內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志.可以通過(guò)測(cè)定vWF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。在我們?cè)O(shè)定的分化體系中,經(jīng)過(guò)14天的誘導(dǎo),BMSCs獲得了成熟的內(nèi)皮細(xì)胞的特征性標(biāo)志如vWF、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（KDR）,延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間,增加這些因子的表達(dá)。HLA-DR主要存在于B淋巴細(xì)胞,單個(gè)核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上,在較為原始的干細(xì)胞中表達(dá)較少[10],隨著干細(xì)胞分化為成熟的組織細(xì)胞,表達(dá)量逐漸增加,本實(shí)驗(yàn)中hMSCs不表達(dá)HLA-DR,但誘導(dǎo)后表達(dá)量逐漸增加,表明細(xì)胞分化成熟。CD54在血管新生過(guò)程中也有重要作用,腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變及損傷修復(fù)中是促進(jìn)血管新生的因子之一[11],CD31和CD34為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志,在該誘導(dǎo)體系中三者表達(dá)量明顯增加,是誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的有力證明。

巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)清道夫受體以胞吞方式攝取ac-LDL,但廣泛分布于其他細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體不能攝取ac-LDL,因此ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)常用于鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞[12-14]。我們進(jìn)行的Dil-ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)24天后的BMSCs具有攝取Dil-ac-LDL的能力,證明這種誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

綜上所述,目前的誘導(dǎo)方案能夠誘導(dǎo)hMSCs出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表型,且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)其表型特征也越明顯,提示hMSCs在體外特定條件下具有定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的潛能,而且這種內(nèi)皮樣細(xì)胞具有攝取Dil-ac-LDL的能力,說(shuō)明也有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的功能。由于誘導(dǎo)后細(xì)胞的體外三維成血管實(shí)驗(yàn),既能進(jìn)一步證明我們實(shí)驗(yàn)中hMSCs所分化的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)也能觀察銀屑病患者與正常人hMSCs分化血管內(nèi)皮細(xì)胞在形成血管過(guò)程中的差異,所以在下一步的研究中將增加體外三維成血管實(shí)驗(yàn)。

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[收稿2009-07-25 修回2009-11-02]

（編輯 許四平）

Isolating culture of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the differentiation into b lood vessel endothelial-like cells in vitro

FENGHai-Yan,LIURui-Feng,ZHANGKai-Ming.TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan

Objective:To study of isolating cu lture and differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into blood vesselendothelial-like cells in a specializedmicro-environment in vitro,so as to provide an experimental foundation for psoriasis.Methods:The hMSCs were isolated by density gradient centrifugation,amp lificated and identificated in vitro.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and basic fibroblastgrow th factor（bFGF）within endothelial cellgrow thmedium（DMEM）were used to inducehMSCs differentiation into vascular endothelial-like cells.The induced hMSCswere detected by flow cytometry to find whether they had endothelial cell phenotypes.The Dil-ac-LDL ingestion assaywas used to appraises the blood vessel endothelial-like cell function.Results:In cellmorphology,the induced hMSCs transformed into endothelial-like cells.These cells expressed specific surfacemarkers of vascular endothelial-like cells such as CD34,CD106,HLA-DR,CD54,VWF,CD31,KDR and CD45 comparing to those in the controlgroup（P＜0.01）.The induced endothelial-like cells had the ability of ingesting Dil-ac-LDL.Conclusion:Combination of Density gradient centrifugation and adherentmethods can obtain pure MSCs.hMSCs can obtain endothelial cell phenotypes after induced by VEGF and bFGF in vitro.Human hMSCs have potential to differentiate into vascular endothelial-like cells.The induced endothelial-like cells have completely mature endothelial cell functional properties.

Bonemarrow-derivedmesenchymal stem cells;Vascularendothelial-like cells;Vascularendothelial grow th factor;Basic fibroblast grow th factor

R758.63

A

1000-484X（2010）01-0070-06

①本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30771940）

②山西省太原市中心醫(yī)院皮膚科,太原030000

馮海燕（1979年-）,女,在讀碩士,主要從事銀屑病免疫發(fā)病機(jī)理研究,E-mail:marry671@sohu.com;

及指導(dǎo)教師:張開(kāi)明（1956年-）,男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事銀屑病免疫發(fā)病機(jī)理研究,E-mail:zhangkaiming@sina.com。