nNOS對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

盧曉梅，于艷秋

（中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110001）

nNOS對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

盧曉梅，于艷秋

（中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110001）

目的 應(yīng)用神經(jīng)型一氧化氮合酶nNOS基因缺失小鼠，探討nNOS對心肌缺血再灌注損傷的影響。方法 野生型C57小鼠和nNOS基因缺失小鼠分別經(jīng)過冠狀動脈左前降支缺血30min再灌注3h，觀察TUNEL染色和caspase-8，-9，-3的活性變化，并用Western blot法觀察磷酸化p38激酶和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的表達(dá)情況。結(jié)果 心肌缺血30min再灌注3h后，與假手術(shù)組相比，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增加，caspase-8，-9，-3活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。野生組與基因缺失組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，caspase活性增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示野生型小鼠缺血再灌注損傷后磷酸化p38和ERK激酶活性增強，而基因缺失組p38激酶活性降低，ERK活性不受影響。結(jié)論 nNOS具有加重心肌缺血再灌注損傷的作用，其作用可能為p38介導(dǎo)。

缺血再灌注；神經(jīng)型一氧化氮合酶；絲裂原激活的蛋白激酶

心肌梗死是常見的心血管事件，治療時恢復(fù)血流卻可能導(dǎo)致缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IR）［1］。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）通過催化產(chǎn)生NO在調(diào)節(jié)冠狀動脈節(jié)律和心肌收縮性方面發(fā)揮重要的作用，然而其在缺血再灌注損傷中的作用卻頗有爭議。大部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示誘導(dǎo)型 NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）或者內(nèi)皮型 NOS（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在IR時起保護(hù)作用［2］，另一些實驗卻發(fā)現(xiàn)iNOS或eNOS起損傷作用［3］。而神經(jīng)型 NOS（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）雖然在心率、鈣循環(huán)、鈉轉(zhuǎn)運和能量代謝中都發(fā)揮重要作用［4］，但在心肌缺血再灌注損傷中的作用還不清楚。

應(yīng)激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinases，SAPKs）包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶（external-signal regulated kinase，ERK），Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的p38MAPK激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和組織損傷［5］。越來越多的研究證明NO參與SAPKs激活，但是nNOS在缺血再灌注損傷中對SAPKs的激活作用仍不清楚。

本研究應(yīng)用nNOS基因敲除小鼠探討了nNOS在心肌缺血再灌注損傷中的作用以及在此過程中SAPKs激活的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組：（1）基因缺失（KO）IR組（n＝9）：12周齡 nNOSKO鼠 （Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA），雄性，體質(zhì)量 25～30g；（2）野生型（WT）IR組（n＝11）：12周齡 C57BL/6小鼠（Clea，日本），雄性，體質(zhì)量 25～30g；（3）WT假手術(shù)組（n＝9）；（4）KO假手術(shù)組（n＝9）。均由日本香川大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。

1.1.2 試劑：TUNEL試劑盒（Calbiochem，Darmstadt，Germany）；caspase-3，-8，-9活性試劑盒（Chemicon International Inc.，USA）；抗體（Cell Signaling Technology，USA）；ECL發(fā)光系 統(tǒng) （ECLkit，Amersham Pharmacia，GEHealthcare，UK）；蛋白測定試劑盒（Bio-Rad，USA）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備：苯巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，人工呼吸機輔助呼吸。打開左前胸，暴露心臟。用7/0尼龍絲線在左心耳下方2mm結(jié)扎冠狀動脈左前降支，顯微鏡下確認(rèn)，結(jié)扎30min后松開恢復(fù)再灌注3h。假手術(shù)組打開胸腔暴露心臟，而不結(jié)扎動脈。灌注期結(jié)束取下心臟。

1.2.2 心肌細(xì)胞凋亡的測定：用TUNEL法測定。OCT包裹心臟組織制成4μm冰凍切片，染色。熒光顯微鏡觀察熒光染色。每個標(biāo)本取3張切片，每片測定10個區(qū)域，每個區(qū)域計算細(xì)胞核的數(shù)量以及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量。caspase-3，-8，-9活性的檢測根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 Western blot測定MAPK蛋白表達(dá)：利用組織細(xì)胞裂解液抽提總蛋白，蛋白測定試劑盒測定組織蛋白含量。取等量的蛋白（50μg）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，phospho-p38、phospho-ERK、總 p38、ERK、β-actin一抗孵育，4℃過夜。二抗孵育1h后，顯色系統(tǒng)顯色。Western blot條帶用NIHImage software分析灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 死亡率

假手術(shù)組動物無死亡，WTIR組死亡率為27.3%，KOIR組死亡率為22.2%。

2.2 IR誘導(dǎo)的凋亡

TUNEL染色結(jié)果顯示，WTIR組和假手術(shù)組凋亡細(xì)胞的陽性百分比為（14.58±0.28）%及（0.59±0.13）%；KOIR組和假手術(shù)組凋亡細(xì)胞的陽性百分比為（6.24±0.31）%及（0.58±0.15）%，與 WTIR組相比，KOIR組的TUNEL染色凋亡細(xì)胞的陽性百分比顯著降低（P<0.05）。見圖1，2。WT假手術(shù)組和KO假手術(shù)組caspase-3，-8和-9的活性沒有明顯差異，而在WTIR組它們的活性分別升至（1.68±0.12）倍、（2.23±0.11）倍和（1.48±0.09）倍，在 KOIR組它們的活性分別升至（1.32±0.06）倍、（1.61±0.09）倍和（1.25±0.08）倍，與WTIR組相比，KOIR組小鼠caspase活性明顯降低（P<0.05）。見圖3。

2.3 MAPK活性

為了研究nNOS和SAPKs激活在心肌IR中的作用，我們檢測了磷酸化p38激酶和ERK，總p38激酶和ERK以及β-actin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，WTIR組磷酸化的p38激酶和ERK的表達(dá)分別增加（2.00±0.23）倍和（1.50±0.20）倍。盡管與WT假手術(shù)組相比，KOIR組磷酸化的p38激酶的表達(dá)增加（1.24±0.09）倍，但是卻顯著低于WTIR組 （P<0.05）。KOIR組磷酸化的ERK也增加至（1.40±0.09）倍，但是與WTIR組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4，5。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明NOS在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，盡管許多研究顯示NOS在IR誘導(dǎo)的心肌損傷中起保護(hù)作用［6］，然而，也有一些研究顯示，心肌缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)NO和超氧陰離子作用生成過氧亞硝酸鹽，參與急性IR造成的損傷［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，nNOS加重了小鼠心肌缺血再灌注損傷，可能與以下機制有關(guān)：（1）線粒體部位nNOS的激活可以導(dǎo)致一過性線粒體ATP抑制，從而抑制心肌收縮力；（2）心肌肌漿內(nèi)nNOS激活，肌漿網(wǎng)局部釋放NO，在心肌細(xì)胞鈣離子調(diào)節(jié)及心肌收縮中發(fā)揮重要作用；（3）神經(jīng)纖維內(nèi)的nNOS激活降低了心率和氧耗。已有研究證明，nNOS基因缺失小鼠離體心臟梗死率降低，與本研究結(jié)果一致。盡管如此，nNOS在心肌缺血再灌注損傷中的確切作用仍然有待進(jìn)一步研究。

哺乳動物細(xì)胞在心肌缺血后會激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷可以激活ERK和p38。p38是爭議最多的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，多數(shù)研究證明，p38的激活或者發(fā)生在缺血時，或者在再灌注期延續(xù)時，抑制p38激活可延緩梗死的發(fā)展，增加細(xì)胞存活率，降低心肌細(xì)胞凋亡并增加缺血后心臟功能的恢復(fù)［8］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血的致死期抑制p38MAPK不會影響IR誘導(dǎo)的損傷程度［9］。許多研究證明，NO參與SAPKs激活，eNOS抑制心肌缺血再灌注損傷時可見p38激酶的激活。本研究結(jié)果顯示，p38激活在KOIR小鼠降低，說明p38參與了NOS介導(dǎo)的心肌IR損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在nNOSKO小鼠心肌損傷程度和p38磷酸化程度降低，說明nNOS具有加重心肌缺血再灌注損傷的作用，且該作用與激活p38有關(guān)。

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［3］Gross ER，Gross GJ.Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：212-221.

［4］Melikian N，Seddon MD，Casadei B.Neuronal nitric oxide synthase and human vascular regulation［J］.Trends Cardiovasc Med，2009，19（8）：256-262.

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（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Effect of Neuronal Nitric Oxide Synthase on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Mice

LUXiao-mei，YUYan-qiu
（Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of neuronal nitric oxide synthase （nNOS）on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.MethodsIn nNOS-/-（KO）mice and wild type C57（WT）mice，the left anterior descending coronary artery were ligated for 30minutes，followed by 3-hour reperfusion.The cardiac myocyte apoptosis was detected by TUNELstaining，and the activities of caspase-3，-8，and-9and the expressions of phospho-p38mitogen-activated protein kinase（MAPK）and extracellular signal-regulated kinase（ERK）were determined by Western blot.ResultsCompared with control group，the number of TUNELpositive cells and the activities of caspase-3，-8，and-9significantly increased after 30-minute ischemia followed by 3-hour reperfusion （P<0.05）.The number of TUNELpositive cells and the activities of caspase-3，-8，and-9were significantly higher in WTmice than in KOmice （P<0.05）.After ischemia-reperfusion injury，the activities of phospho-p38and ERKincreased in WTmice，but in KOmice，the activity of phospo-p38decreased and the activity of ERKwas unchanged.ConclusionnNOSmay exacerbate ischemia-reperfusion injury，in which p38MAPKmay be involved.

ischemia-reperfusion；neuronal nitric oxide synthase；mitogen-activated protein kinase

R363.2

A

0258-4646（2010）11-0919-03

遼寧省教育廳高校科研基金資助項目（20060946）

盧曉梅（1978－），女，講師，碩士.

于艷秋，E-mail：yqyu@mail.cmu.edu.cn

2010-05-13