鋅對(duì)前列腺癌22RV1細(xì)胞的增殖及ZIP4mRNA表達(dá)的影響

陳啟光，馬東蔚，張哲，單廣夷，孔垂?jié)?/p>

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院1.泌尿外科；2.內(nèi)分泌科，沈陽(yáng) 110001）

鋅對(duì)前列腺癌22RV1細(xì)胞的增殖及ZIP4mRNA表達(dá)的影響

陳啟光1，馬東蔚2，張哲1，單廣夷1，孔垂?jié)?

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院1.泌尿外科；2.內(nèi)分泌科，沈陽(yáng) 110001）

目的 探討鋅對(duì)前列腺癌22RV1細(xì)胞的增殖及對(duì)ZIP4mRNA表達(dá)的影響。方法 采用倒置相差顯微鏡觀察并采用MTT法檢測(cè)不同濃度鋅（0.5、5、50、100μmol/L）對(duì)前列腺癌22RV1細(xì)胞的形態(tài)及增殖活性的影響，實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)不同濃度鋅在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)ZIP4mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 在鋅濃度為0.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞皺縮，形態(tài)發(fā)生明顯變化，增殖活性下降，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余3組未見明顯變化（P＞0.05）。隨著鋅作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ZIP4mRNA表達(dá)量下降，36h達(dá)最低值之后保持恒定；當(dāng)鋅濃度為0.5μmol/L時(shí)，ZIP4mRNA的表達(dá)量變化與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各濃度組變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。結(jié)論 鋅在一定濃度水平上可以抑制前列腺癌22RV1細(xì)胞的增殖活性，且對(duì)ZIP4mRNA的表達(dá)具有時(shí)間和劑量依賴性。

鋅；前列腺癌；22RV1；增殖；ZIP4

鋅是人體必須的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，是體內(nèi)200多種含有鋅指結(jié)構(gòu)的酶和轉(zhuǎn)錄因子保持活性并參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成和催化活性的必要組成部分［1，2］。與鋅相關(guān)的某些酶在缺氧、血管生成、細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移中扮有重要角色。研究表明，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中鋅濃度下降達(dá)62%～75%［3，4］，前列腺的外周帶具有高度特異性的腺分泌上皮細(xì)胞能聚集高濃度的鋅離子，是前列腺癌的好發(fā)部位，因而推測(cè)鋅在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。鋅鐵調(diào)控蛋白（ZRT，IRT-like protein，ZIP）家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，其主要功能是將鋅離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，與鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體（zinc transporter，ZnT）家族共同作用維持細(xì)胞內(nèi)鋅離子的穩(wěn)定，ZIP4是ZIP家族的一員，在鋅離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用［5］。本研究以不同濃度的鋅離子作用于前列腺癌22RV1細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖活性及對(duì)細(xì)胞內(nèi)ZIP4mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（TBD公司），TRIZOL（Invitrogen公司），SYBR誖PrimeScriptTMRT-PCRKit II（Perfect Real Time）（Takara公司），引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，ZnCl2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)（分析純?cè)噭?。紫外分光光度?jì)（美國(guó)Thermo公司），ROTOR-GENE6000離心式熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌22RV1細(xì)胞，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的孵箱內(nèi)，隔日換液，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液隔日消化、傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入終濃度為 0.5μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的ZnCl2，每孔終體積為 200μl，每個(gè)濃度設(shè) 5個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔，周邊孔用PBS填充，置37℃、5%CO2孵箱中，分別于 12h，24h，36h，48h，60h終止培養(yǎng)，每孔加入新鮮配制的MTT溶液（5mg/ml），于37℃繼續(xù)孵育4h后棄孔中培養(yǎng)液，加入150μl DMSO（二甲基亞砜），避光低速振蕩10min，于酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)490nm處測(cè)定各孔吸光度值（A值）。

1.4 總RNA提取及cDNA的合成

不同濃度 ZnCl2作用 12h，24h，36h及 48h后，按5×106～1×107個(gè)細(xì)胞加1ml TRIZOL低溫吹打；按說(shuō)明書提取總RNA。用DEPC處理的超純水溶解RNA，60℃孵育5min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，分光光度計(jì)測(cè)定其260nm吸光度和濃度。cDNA合成的反應(yīng)體系：（1）5×PrimeScriptTMbuffer（for Real Time）4μl；（2）PrimeScriptTMRTenzyme mix I1μl；（3）Oligo dTprimer（50μmol/L）1μl；（4）Random 6mers（100μmol/L）1μl；（5）total RNA1μg；（6）加 RNase free dH2O至 20μl反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃，15min；85℃，15s反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

采用SYBRGreen嵌合熒光進(jìn)行反應(yīng)，按說(shuō)明書配制 12.5μl的反應(yīng)體系：（1）SYBR誖Premix Ex TaqTMII（2×）6.25μl；（2）PCRforward primer（10μmol/L）0.5μl；（3）PCRreverse primer（10μmol/L）0.5μl；（4）模板（cDNA溶液）1μl；（5）dH2O4.25μl。陰性對(duì)照組加入未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板。引物序列：ZIP4上游：5′ATGTCAGGAGCGGGTCTTGC3′；下游：5′GCTGCTGTGCTGCTGGAAC3′。β-actin上游：5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′；下游：5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火 20s，72℃延伸30s同時(shí)獲取熒光，共40個(gè)循環(huán)，行產(chǎn)物的溶解曲線分析。

1.6 Comparative Delta-delta Ct法行相對(duì)定量分析

首先選前列腺癌細(xì)胞株22RV1標(biāo)本作為校正組，然后對(duì)樣品中的目的基因DD3與管家基因βactin分別連續(xù)10倍稀釋后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率是否一致或接近；將擴(kuò)增效率優(yōu)化為一致，然后對(duì)目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Zn2+對(duì)22RV1細(xì)胞形態(tài)的影響

分別于不同的時(shí)間點(diǎn)在倒置相差顯微鏡下觀察不同濃度Zn2+對(duì)前列腺癌22RV1細(xì)胞形態(tài)的影響，在鋅離子濃度為0.5μmol/L時(shí)可明顯觀察到22RV1細(xì)胞突起消失，細(xì)胞皺縮變圓，部分細(xì)胞懸浮，而在其余 3個(gè)濃度（5μmol/L、50μmol/L和 100μmol/L）時(shí)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。見圖1。

2.2 不同濃度鋅對(duì)22RV1增殖活性的影響

分別于不同的時(shí)間點(diǎn)采用MTT法檢測(cè)不同濃度鋅離子對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示，在鋅離子濃度為0.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余3組與對(duì)照組相比，Zn2+對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 鋅對(duì)22RV1細(xì)胞ZIP4mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)

實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分別檢測(cè)不同濃度鋅離子在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)22RV1細(xì)胞ZIP4mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，隨著鋅作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ZIP4表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。在鋅濃度為50μmol/L時(shí)，相對(duì)于對(duì)照組在 12h，24h，36h，48h，72h 時(shí)ZIP4mRNA表達(dá)量變化分別為 0.98±0.05，0.66±0.04，0.46±0.02，0.44±0.02，0.45±0.02。在 12h 時(shí)ZIP4mRNA表達(dá)量未見明顯變化（P＞0.05），36h時(shí)ZIP4mRNA下降達(dá)到最低值，之后恒定保持在較低水平，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

2.4 鋅對(duì)22RV1細(xì)胞ZIP4mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng)

實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)了不同濃度鋅離子對(duì)22RV1細(xì)胞作用36h后ZIP4mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，ZIP4mRNA的表達(dá)水平隨鋅離子濃度的上升而下降，與對(duì)照組相比，在鋅離子濃度為0.5μmol/L，5μmol/L，50μmol/L和 100μmol/L時(shí)ZIP4mRNA的表達(dá)量分別為 0.95±0.03，0.74±0.03，0.46±0.02，0.29±0.07。與對(duì)照組相比，鋅濃度為 0.5μmol/L時(shí)，ZIP4mRNA的表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖 4。

3 討論

鋅是很多細(xì)胞和組織必須的微量元素，正常前列腺組織中的鋅含量是其他組織的3～10倍［6］，其聚鋅能力主要由前列腺外周帶高度特異性的腺分泌上皮細(xì)胞完成，F(xiàn)ranklin等［7］將這些細(xì)胞稱為“聚鋅細(xì)胞”。Habib等［8］的研究表明，在前列腺癌發(fā)生的早期階段，腺體中的鋅濃度便開始下降，“聚鋅細(xì)胞”的聚鋅能力開始喪失，提示鋅在前列腺癌的形成階段即開始起作用。鋅鐵調(diào)控蛋白ZIP與許多惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，它在乳腺癌和胰腺癌進(jìn)展中的作用已經(jīng)得到部分證實(shí)［9，10］。Desouki等［11］認(rèn)為，在前列腺癌中ZIP1、ZIP2和ZIP3均表達(dá)下調(diào)的同時(shí)伴鋅水平下降，表明ZIP1、ZIP2和ZIP3可能是一組抑癌基因。ZIP4是由SLC39A4基因所編碼的一種鋅鐵調(diào)控蛋白，在胃腸道上皮中呈高表達(dá)，可通過(guò)促進(jìn)食物中的鋅進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞和囊泡中鋅的釋放而維持細(xì)胞內(nèi)鋅的水平［1，12］。研究顯示，ZIP4的表達(dá)缺失與肌皮炎相關(guān)，其過(guò)表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系［2，10，13］。但到目前為止，ZIP4在前列腺癌中的表達(dá)及其生物學(xué)機(jī)制還不是很清楚。

本研究首次在細(xì)胞水平探討了鋅對(duì)前列腺癌22RV1細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)ZIP4mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在鋅離子濃度為0.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞增殖活性明顯下降，而其他相對(duì)較高鋅濃度時(shí)卻未觀察到此現(xiàn)象。因而我們推測(cè)其可能機(jī)制是：（1）鋅離子在一定濃度范圍內(nèi)變化時(shí)，細(xì)胞對(duì)自身鋅離子穩(wěn)態(tài)監(jiān)測(cè)未啟動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度不斷增加，產(chǎn)生細(xì)胞毒性抑制細(xì)胞增殖或直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡；（2）通過(guò)抑制細(xì)胞周期的某一階段或通過(guò)某種機(jī)制啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路而使細(xì)胞增殖活性下降凋亡增加，對(duì)此作用機(jī)制的推測(cè)我們會(huì)通過(guò)后續(xù)研究進(jìn)一步探討。同時(shí)，本研究應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)了不同時(shí)間不同濃度鋅對(duì)ZIP4mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，隨時(shí)間的增加，ZIP4mRNA表達(dá)隨之降低，36h時(shí)降至最低值；而且隨著鋅濃度的增加，ZIP4mRNA的表達(dá)量亦隨之下降。結(jié)果提示，前列腺癌22RV1細(xì)胞中ZIP4mRNA的表達(dá)量受外環(huán)境中鋅的調(diào)控，并具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。在高鋅狀態(tài)下，細(xì)胞可通過(guò)減少ZIP4mRNA的表達(dá)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)鋅的穩(wěn)態(tài)，而保持細(xì)胞特性。

綜上所述，在一定的濃度水平，鋅離子可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖活性。同時(shí)在不同時(shí)間不同濃度鋅離子作用下，ZIP4mRNA的表達(dá)具有時(shí)間和劑量效應(yīng)，其在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起何種作用，與其他鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體如何相互作用、共同參與鋅穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)尚有待進(jìn)一步研究。

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（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Effect of Zinc on the Proliferation of Prostate Cancer Cell Line 22RV1and the Expression ofZIP4mRNA

CHENQi-guang1，MADong-wei2，ZHANGZhe1，SHANGuang-yi1，KONGChui-ze1
（1.Department of Urology；2.Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of zinc on the proliferation of prostate cancer cell line 22RV1and the expression ofZIP4mRNA.MethodsThe morphology of 22RV1cells exposed to different concentrations of zinc was observed under phase contrast microscope，and the proliferative activity of 22RV1cells was detected by MTTassay.The effect of different concentrations of zinc on the expression ofZIP4mRNAwas determined by real-time quantitative polymerase chain reaction at different time points.ResultsIn 22RV1cells exposed to zinc of 0.5μmol/L，obvious morphological changes were found，and the proliferative activity significantly decreased compared with control group （P＜ 0.01）.No signficant difference in the proliferative activity was found between 22RV1cells exposed to zinc of 5，50，and 100μmol/Land control group （P＞0.05）.The expression ofZIP4mRNAdecreased with the duration of zinc exposure and reached the lowest level after 36hours，and then the level ofZIP4mRNAmaintained.Compared with the control group，the expression ofZIP4mRNAsignificantly decreased in 22RV1cells exposed to zinc of 5，50，and 100μmol/L，except for the cells exposed to zinc of 0.5μmol/L.ConclusionWithin a certain range of concentration，zinc can inhibit the proliferation of prostate cancer cell line 22RV1，and has a time-and dose-dependent effect on the expression ofZIP4mRNA.

zinc；prostate cancer；22RV1；proliferation；ZIP4

R737.25

A

0258-4646（2010）11-0908-04

遼寧省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2007225002-1，2007216010）

陳啟光（1983－），男，博士研究生.

孔垂?jié)桑珽-mail：wzhoucmu@163.com

2010-04-09