基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1在IgA腎病小鼠腎臟的表達(dá)及FTY720對(duì)其的影響

羅軍，王紫，周建華

（華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，武漢 430030）

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1在IgA腎病小鼠腎臟的表達(dá)及FTY720對(duì)其的影響

羅軍，王紫，周建華

（華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，武漢 430030）

目的 探討基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）在IgA腎病小鼠的表達(dá)以及FTY720對(duì)SDF-1表達(dá)的影響。方法 30只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只。IgA腎病模型組及FTY720治療組均采用黏膜免疫復(fù)合物法造模，第9周起對(duì)FTY720組給予FTY720干預(yù)，另設(shè)正常對(duì)照組。收集實(shí)驗(yàn)第4、8、12周時(shí)尿液，檢測(cè)尿紅細(xì)胞及尿蛋白定量；第12周末處死動(dòng)物留取腎臟，普通光鏡及免疫熒光法檢測(cè)腎臟病理改變，SABC法檢測(cè)腎臟SDF-1蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析腎臟SDF-1mRNA的表達(dá)差異。結(jié)果 模型組小鼠自8周后開始出現(xiàn)蛋白尿，腎臟呈現(xiàn)典型的系膜增殖性改變，F(xiàn)TY720干預(yù)組蛋白尿及腎小球病變較輕。SDF-1蛋白在正常小鼠及經(jīng)FTY720干預(yù)小鼠腎臟組織均呈低表達(dá)，但在模型鼠腎臟組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。SDF-1mRNA在模型組小鼠腎臟組織中的表達(dá)較正常組有所增加，而在經(jīng)FTY720干預(yù)的小鼠腎臟組織中的表達(dá)則較模型組明顯減少。結(jié)論 SDF-1可能作為IgA腎病腎臟損傷及腎間質(zhì)纖維化的一項(xiàng)指標(biāo)存在。FTY720對(duì)IgA腎病具有良好的治療效果，它可能通過影響SDF-1在腎臟的表達(dá)發(fā)揮治療作用。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1；IgA腎?。籉TY720；小鼠

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是歸屬于CXC趨化因子家族的一種趨化因子，在腎臟可持續(xù)性表達(dá)，近年來的研究表明其與受體CXCR4所形成的SDF-1/CXCR4軸在慢性腎臟疾病的發(fā)病及進(jìn)展等方面扮演重要角色，但作用機(jī)制尚未明確。FTY720是一種新合成的具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性的免疫抑制劑，在慢性抗thy-1腎小球硬化模型及單側(cè)輸尿管梗阻模型中，可以明顯抑制腎間質(zhì)纖維化，延緩腎小球硬化進(jìn)程［1，2］。本研究通過使用FTY720對(duì)小鼠IgA腎病模型進(jìn)行干預(yù)，觀察了FTY720對(duì)IgA腎病小鼠的預(yù)防及治療效果，探討了SDF-1在IgA腎病小鼠的表達(dá)狀況以及FTY720對(duì)其的影響，以期為IgA腎病的靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組和處理：BALB/c小鼠30只，雌性，體質(zhì)量18～20g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為正常對(duì)照組、IgA腎病模型組、FTY720治療組，每組10只。模型組及FTY720治療組均建立IgA腎病模型，采用隔日0.4ml 0.1%牛血清白蛋白（BSA）酸化水（6mmol/L鹽酸）灌胃，第6周定時(shí)尾靜脈注射1%BSA緩沖液（0.4ml/只，每日1次，連續(xù)3d），第9周起尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B，劑量為0.4mg/kg/周，每周1次，連續(xù)3周。FTY720治療組自第9周起同時(shí)給予0.5mg/kg·d-1的FTY720水溶液灌胃，共4周，其他處理同模型組。對(duì)照組自由進(jìn)食、飲水。12周末為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，處死動(dòng)物，收集腎臟組織備用。

1.1.2 儀器與試劑：PRISM7000HTRealTime RTPCR擴(kuò)增儀（ABI公司）；FTY720（Cayman公司）；SybryGreen RealTime RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；SDF-1引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）；兔抗小鼠SDF-1抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 24 h尿蛋白定量：于實(shí)驗(yàn)第4、8、12周末時(shí)將各組小鼠置代謝籠，收集24h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白定量。

1.2.2 尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)：上述收集尿液標(biāo)本同時(shí)采用定量尿沉渣計(jì)數(shù)法檢測(cè)尿紅細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 腎臟常規(guī)病理學(xué)檢查：小鼠處死后即留取腎皮質(zhì)，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3～4μm，常規(guī)脫蠟入水，行 HE、PAS、Masson 及 PASM染色，光鏡下觀察腎臟基本病理改變情況。

1.2.4 腎組織IgA免疫熒光檢測(cè)：留取新鮮腎皮質(zhì)標(biāo)本，冰凍切片后采用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG及兔抗小鼠IgA對(duì)腎切片行間接免疫熒光法檢查。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SDF-1的表達(dá)：腎臟石蠟切片，厚3～4μm，常規(guī)脫蠟并經(jīng)抗原修復(fù)。一抗為兔抗小鼠SDF-1多克隆抗體，二抗為羊抗兔SABC試劑盒，采用SABC法檢測(cè)腎組織中SDF-1的表達(dá)，陽性部位呈棕黃色。

1.2.6 定量PCR技術(shù)檢測(cè)腎臟SDF-1mRNA的表達(dá)：提取腎組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Realtime RT-PCRSybryGreen染料法對(duì)組織中SDF-1模板進(jìn)行擴(kuò)增，并使用2-ΔΔCt法計(jì)算初始mRNA的相對(duì)值，分析基因表達(dá)差異。管家基因GAPDH作為組內(nèi)參基因，各樣本的ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（目標(biāo)組）-ΔCt（對(duì)照組）。SDF-1引物序列：5′GCTCTGCATCAGTGACGG3′（正義鏈），5′TAATTACGGGTCAATGCACA3′（反義鏈）。GAPDH引物序列：5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′（正義鏈），5′GATGGCATGGACTGTGGTCAT3′（反義鏈）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包行t檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 24h尿蛋白定量檢測(cè)及血尿檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠尿蛋白定量于觀察第4周末時(shí)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，自8周末始模型組小鼠尿蛋白較正常對(duì)照組開始增加，12周末時(shí)達(dá)高峰；經(jīng)FTY720干預(yù)的小鼠尿蛋白定量于8周末及12周末時(shí)均增加，但低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組小鼠均未見肉眼血尿，模型組小鼠可見8例（80%）鏡下血尿，F(xiàn)TY720治療組可見3例（30%）鏡下血尿，對(duì)照組各期均未見血尿。

表1各組小鼠24h尿蛋白定量（n=10，mg/24h，±s）Ta b.124-h o u r u r i n ep r o t e i ni nmi c eo f e a c hg r o u p（n=10，mg/24h，±s）Group Week 4 Week 8 Week 12Control 0.79±0.06 0.87±0.07 0.81±0.071）IgANmodel 0.87±0.09 1.16±0.11 2.07±0.17FTY720 0.89±0.07 1.12±0.14 1.35±0.111）1）P＜ 0.05vs IgANmodel group.

2.2 腎組織常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

正常組小鼠腎小球均未見明顯變化，模型鼠呈現(xiàn)典型的系膜增生性腎炎病變，系膜基質(zhì)多呈中重度增生，部分腎小球肥大，腎小囊上皮細(xì)胞小管樣化生，并可見球囊粘連。FTY720治療組腎小球系膜增殖性改變明顯較輕。見圖1。

2.3 腎組織IgA免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

新鮮腎皮質(zhì)標(biāo)本冰凍切片后，采用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG及兔抗小鼠IgA對(duì)腎切片行間接免疫熒光法檢查，可見模型組及FTY720治療組IgA呈團(tuán)塊狀沉積于系膜區(qū)，模型組熒光強(qiáng)度達(dá)（++++）。

2.4 腎組織中SDF-1免疫組化檢測(cè)結(jié)果（圖2）

SDF-1蛋白在正常小鼠腎臟組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，在模型組腎臟組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在經(jīng)FTY720干預(yù)小鼠腎臟組織呈低表達(dá)。正常小鼠及FTY720干預(yù)小鼠腎臟組織中SDF-1蛋白陽性表達(dá)主要出現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞，模型組腎小球亦可見少量表達(dá)，而在各組小鼠腎間質(zhì)均缺乏表達(dá)。

2.5 腎組織中SDF-1mRNA檢測(cè)結(jié)果

令正常對(duì)照組小鼠腎臟組織中SDF-1的初始模板基因表達(dá)量為1，使用2-ΔΔCt法計(jì)算出模型組及FTY720處理組小鼠腎臟SDF-1的初始模板相對(duì)表達(dá)平均值分別為1.54及1.07（表2）。可見SDF-1mRNA在模型組小鼠腎臟組織中的表達(dá)較正常組有顯著增加（P＜0.05），而在經(jīng)FTY720干預(yù)的小鼠腎臟組織中的表達(dá)則較模型組明顯減少（P＜0.05）。

表2各組小鼠SDF-1初始模板基因相對(duì)表達(dá)量（n=10，±s）Ta b.2Re l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o fSDF-1mRNAi n mo u s e k i d n e y（n=10，±s）Group ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCt Control 4.86±0.26 0 1IgANmodel 4.24±0.34 －0.62±0.08 1.54±0.181）FTY720 4.76±0.35 -0.10±0.05 1.07±0.162）1）P＜0.05vs control group；2）P＜0.05vs IgANmodel group.

3 討論

本研究參照經(jīng)典方法制做小鼠IgA腎病模型［3，4］，結(jié)果出現(xiàn)典型的蛋白尿及IgA腎病病理改變，說明模型制作較為成功。與此同時(shí)，本研究通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)了SDF-1蛋白在各組小鼠腎臟的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SDF-1在正常小鼠腎小管上皮細(xì)胞呈低表達(dá)狀態(tài)，在模型組腎小管則呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在腎間質(zhì)各組小鼠均缺乏陽性表達(dá)，這與Loten［5］用免疫組織化學(xué)檢測(cè)IgA腎病患者腎臟SDF-1表達(dá)的結(jié)果相似。通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)模型組小鼠SDF-1mRNA在腎臟中的表達(dá)增加，與免疫組化檢測(cè)結(jié)果吻合，與國內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)其他慢性腎臟疾病如狼瘡性腎炎、慢性缺氧導(dǎo)致腎硬變等的研究結(jié)果相似［6，7］。Gao［8］在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)同種腎移植后12周，單用環(huán)孢素A組的SDF-1水平是用環(huán)孢素A+抗SDF-1抗體組的2倍，是正常對(duì)照的4倍，故推測(cè)SDF-1是慢性腎臟疾病腎臟損傷程度的一項(xiàng)指標(biāo)，SDF-1表達(dá)越高，腎臟損傷程度越重。

本研究中采用FTY720進(jìn)行干預(yù)的小鼠蛋白尿及病理改變均較模型組小鼠明顯減輕。此外，在經(jīng)FTY720干預(yù)的小鼠腎臟組織中，SDF-1蛋白僅有微量表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)亦證實(shí)SDF-1mRNA在腎臟的表達(dá)較模型組小鼠有明顯減少。目前一般認(rèn)為FTY720主要通過非選擇性作用于淋巴細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體，將淋巴細(xì)胞阻滯在次級(jí)淋巴器官，使其不能加入全身循環(huán)而發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)［9］。由于SDF-1是淋巴細(xì)胞的強(qiáng)趨化因子，在腎臟表達(dá)增高可以驅(qū)動(dòng)淋巴細(xì)胞包括IgA分泌細(xì)胞向腎臟分布，最終導(dǎo)致腎臟局部的炎性反應(yīng)和損傷。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)TY720對(duì)小鼠IgA腎病具有良好的預(yù)防及治療效果，它可能通過上述機(jī)制發(fā)揮作用，同時(shí)也可能因減少趨化因子SDF-1在腎臟的表達(dá)，進(jìn)而影響相關(guān)黏附分子的表達(dá)以及相互作用，最終進(jìn)一步減少淋巴細(xì)胞向小管間質(zhì)的浸潤，減輕淋巴細(xì)胞所分泌的淋巴因子和炎性介質(zhì)對(duì)腎臟組織的損傷，延緩了腎臟纖維化的進(jìn)程，從而達(dá)到治療作用。而FTY720如何作用于趨化因子SDF-1，以及與其他相關(guān)黏附分子相互作用關(guān)系亦有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)TY720的治療作用可能通過減少SDF-1在腎臟的表達(dá)而發(fā)揮，以SDF-l/CXCR4為靶向的研究將可能為IgA腎病及其他慢性腎臟病的治療提供新的思路。

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（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Effect of FTY720on the Expression of Stromal Cell-derived Factor-1in Mouse Model of IgANephropathy

LUOJun，WANGZi，ZHOUJian-hua
（Department of Pediatrics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

ObjectiveTo study the effect of FTY720on the expression of stromal cell-derived factor-1（SDF-1）in mouse model of IgAnephropathy （IgAN）.MethodsAtotal of 30female BALB/c mice were randomly divided into 3groups （n=10each group）：control group，IgANmodel group，and FTY720group.The 24-hour urine protein was quantified by coomassie brilliant blue at weeks 4，8，and 12.All the mice were killed after 12weeks，and the kidneys were sampled.The pathological changes in the kidney were observed under light microscope and detected by immunofluorescence.The levels of SDF-1protein and mRNAin the kidney were detected by SABCimmunohistochemical method and real-time reverse transcription polymerase chain reaction，respectively.ResultsProteinuria and mesangial cell proliferation were observed in IgANmodel group since week 8，and these pathological changes were less severe in FTY720group.The expression level of SDF-1protein was low in control and FTY720groups，but strongly positive expression of SDF-1protein was found in IgANgroup.The expression ofSDF-1mRNAin IgANmodel group increased，compared with control group.The expression ofSDF-1mRNAwas lower in FTY720group than in IgANmodel group.ConclusionSDF-1might be an indicator of renal injury and fibrosis of IgAN.FTY720has a good therapeutic effect on IgANby affecting the expression ofSDF-1in the kidney.

stromal cell-derived factor-1；IgAnephropathy；FTY720；mouse

R692.6

A

0258-4646（2010）11-0895-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872797）

羅軍（1973-），男，主治醫(yī)師，博士研究生.

周建華，E-mail：jhzhou@tjh.tjmu.edu.cn

2010-08-03

·論著·