流感病毒反向遺傳技術(shù)合成rH5/PR8融合病毒的免疫學(xué)相關(guān)研究

喬瑩，才娜，溫慶華，蔡鑫澤，韓曉旭，趙連爽，尚紅

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院中心實驗室，沈陽 110001）

流感病毒反向遺傳技術(shù)合成rH5/PR8融合病毒的免疫學(xué)相關(guān)研究

喬瑩，才娜，溫慶華，蔡鑫澤，韓曉旭，趙連爽，尚紅

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院中心實驗室，沈陽 110001）

目的 研究用流感病毒反向遺傳技術(shù)合成的rH5/PR8融合病毒株的免疫學(xué)特性，為人工合成的融合流感病毒株，作為疫苗株的免疫性、有效性、穩(wěn)定性及可持續(xù)性提供科學(xué)數(shù)據(jù)。方法 用流感病毒反向遺傳技術(shù)合成減毒rH5/PR8融合病毒株，用動物實驗確認(rèn)此病毒株的免疫原性、免疫穩(wěn)定性及免疫防御實驗確認(rèn)防御效果。結(jié)果 人工合成的rH5/PR8融合病毒株除HA外，均來自A/PR/8/34（PR8），HA來自H5N1強致病性雞流感病毒，剪除第346-349的堿性氨基酸（RKKR）部位。用滅活rH5/PR8病毒免疫雞后，平均抗體水平HITiter達(dá)到29以上，持續(xù)達(dá)1個月之久；免疫原在一定條件下保存2個月及4個月后重復(fù)上述實驗，抗體水平上升與立即免疫組相似，有效抗體水平可持續(xù)到免疫后7個月以上，表明rH5/PR8病毒HA5抗原穩(wěn)定，不易被降解；免疫防御實驗表明：非免疫組雞的死亡率達(dá)到60%左右，而免疫組無死亡，防御率達(dá)到100%，表明免疫防御有效。結(jié)論 用流感病毒反向遺傳技術(shù)合成的人工融合減毒病毒rH5/PR8株，外來基因HA5抗原性安定、免疫原性可靠，有效抗體持續(xù)時間長，免疫防御有效。

流感病毒反向遺傳技術(shù)；流感病毒；強致病雞禽類流感病毒；疫苗

A型流感病毒（influenza Avirus）流感病毒是危害人類健康的重要病原體，具有單股、負(fù)義、分段性RNA病毒，有8個分段RNA基因，攜帶著10種病毒蛋白，其中HA，NA是病毒表面糖蛋白抗原（圖1）［1，2］。由于 HA5型流感病毒非人類特異性敏感株，大部分人類沒有HA5抗體存在，1997年香港H5N1型強致病性雞流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）感染人類，并造成 7人死亡的報道引起了WHO的高度重視，為防止世界規(guī)模的大流行，快速有效的疫苗制作及免疫應(yīng)答的相關(guān)研究成為各國緊迫的科研任務(wù)［3～5］。

流感病毒反向遺傳技術(shù)是近年開發(fā)的能夠及時追蹤流感病毒的流行趨勢，開發(fā)快速有效的流感病毒疫苗株的有效方法［7］。本研究應(yīng)用流感病毒反向遺傳技術(shù)，合成人工融合流感病毒（rH5/PR8）。rH5/PR8病毒株除 HA外，NA，NP，PA，PB1，PB2，M，NS基因皆來自PR8；而HA基因來源于H5N1強病毒株，定點突變將第1050堿基從G變?yōu)镃，使344號氨基酸從堿性氨基酸精氨酸（arginine，R）變?yōu)樘K氨酸（threonine，T），同時剪除了第 1054到 1065堿基，使346到349號堿性氨基酸部分缺失。測序證明它的HA分子產(chǎn)生了定點突變和基因剪切，并證實了它有良好的增殖性及對雞呈弱致病性。由于HA5是外來基因并進行了基因剪切處理，因此rH5/PR8病毒株的HA5不但在質(zhì)而且在量上可能發(fā)生了改變，免疫應(yīng)答反應(yīng)效果尚未得到確認(rèn)。本研究旨在對rH5/PR8株免疫原性及免疫防御性進行了進一步的探討研究，為人工合成流感病毒疫苗株的臨床應(yīng)用提供系統(tǒng)、全面的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF白羽來航雞及SPF雞卵均從山東昊泰實驗動物繁育有限公司購入。

1.2 實驗方法

1.2.1 流感病毒紅血球凝集試驗及紅血球凝集抑制實驗：流感病毒紅血球凝集試驗（HAtiter），與流感病毒抗原強弱呈正相關(guān)。以++++的稀釋倍數(shù)表示HATiter，用PBS作為陰性控制。以HATiter為27陽性病毒免疫實驗動物。

紅血球凝集抑制試驗也稱HItiter，與流感病毒抗體強弱呈正相關(guān)。以+++以上的血清稀釋倍數(shù)表示HITiter。

1.2.2 H5/PR8病毒株免疫原有效性實驗：將rH5/PR8融合病毒增殖，用甲醛浸泡滅活后，洗凈。用HATiter為27的滅活病毒加上免疫佐劑后，免疫10日齡SPF白羽來航雞各5只，兩周后加強免疫1次，每周取血1次，測定HI抗體力價。

1.2.3 H5/PR8病毒株免疫原穩(wěn)定性實驗：操作參考H5/PR8病毒株免疫原有效性實驗，制作完成后立即免疫組，與免疫原有效性實驗同樣完成；同時將免疫原在25℃60%濕度下放置保存2個月及4個月，用保存后免疫原每2個月重復(fù)免疫實施一次，共計3次，定期進行采血并進行HITiter抗體價測定。

1.2.4 免疫防御實驗（攻擊實驗）：免疫防御實驗是測定疫苗有效性的直接證明，用滅活rH5/PR8病毒0.2ml（HATiter 27）免疫10日齡SPF白羽來航雞5只，再加強免疫一次（2次免疫組）；免疫21日齡SPF白羽來航雞5只僅一次（1次免疫組），對照組用PBS代替病毒注射21日齡雞5只。通過鼻腔接種HPAI0.1ml（106PFU）感染后，對比它們的生存率，確認(rèn)疫苗株的免疫有效性。并于攻擊開始14d后，摘除肝、肺、腎、腦、腸、脾，取各臟器1g用1ml PBS勻漿后，用病毒空斑實驗測定上清中有否病毒，確認(rèn)相應(yīng)臟器是否有病毒繁殖。

2 結(jié)果

2.1 rH5/PR8病毒株免疫原有效性實驗

為了明確外源的HA5是否也能象HA1一樣在PR8病毒表面表達(dá)充分，也就是說免疫原性高低，一般用免疫動物實驗來完成。用HATiter 27陽性滅活病毒原液0.2ml，加上免疫佐劑液體石蠟經(jīng)調(diào)和后皮下注射免疫10日齡SPF白羽來航雞5只，2周后加強免疫一次。每周靜脈采血，取血清測定HITiter，對照組用PBS代替病毒原液。免疫組血清抗體HITiter從2周開始增高，7周左右達(dá)高峰，HITiter達(dá)29以上，持續(xù)1個月以上，慢慢開始下降（圖2）；對照組未見特異性血清抗體增高（P＜0.05）。

2.2 rH5/PR8病毒株免疫原穩(wěn)定性實驗

免疫抗原制作免疫方法與免疫原有效性實驗相同，免疫每2個月重復(fù)實施1次。一次性制作的免疫抗原保存在溫度252℃，濕度為60%RH5%的條件下，每2個月免疫10日齡雞5只，二個月后加強免疫1次，定期抽血10倍稀釋血清后2倍系列稀釋，測定HITiter。表1為rH5/PR8病毒株免疫原安定性實驗的具體免疫方法及免疫個體HITiter的變化。免疫抗原作成后立即免疫組，5只雞平均HI Titer在免疫后2周左右開始上升，2個月時加強免疫一次，3個月左右抗體水平達(dá)到高峰HITiter達(dá)到27×10，持續(xù)1個月左右開始下降，7個月后HITiter為高峰值的1/2；2個月免疫組抗體上升及下降方式與立即免疫組相同；4個月組免疫組抗體上升與前2組無明顯差異（P＞0.05），表明免疫原沒有因為室溫放置保存而降低免疫效果（圖3）。

2.3 免疫防御實驗（攻擊實驗）

免疫防御實驗是疫苗免疫有效性的直接有效的證明實驗方法。用與免疫原性實驗同樣的方法，免疫10日及21日齡SPF白羽來航雞各5只，分別進行2次免疫（2次免疫組）及1次免疫（1次免疫組），3周后通過雞鼻飼接種0.1ml的106PUF的HPAIV（H5N1）病毒，飼育并觀察一般狀態(tài)。接種后一周左右非免疫對照組5只雞均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，食欲不振，活動力下降、4只出現(xiàn)體質(zhì)量下降，10、11日左右 3只雞陸續(xù)死亡（P＜0.05）（圖 4）。

摘取心、肝、脾、腎、肺、腸保存，用于測定個臟器病毒量。1次免疫組、2次免疫組均未見明顯的臨床癥狀。全部實驗動物于病毒接種后14日處死，3只分取臟器用于臟器病毒檢測。只有非免疫組個體臟器在肝肺中分離到病毒，約為102～103PFU/ml。免疫組的臟器均未分離到病毒。攻擊實驗10日取雞咽頭液進行病毒分離，免疫組未分離到病毒，非免疫組有2只雞分離到病毒（表1）。

表1r H5/PR8疫苗免疫雞后的攻擊實驗Ta b.1Immu n e d e f e n s e a s s a y a f t e r t h e c h i c k e n i mmu n i z e d w i t h r H5/PR8Item Age（day） Boost Symptom Virus in pharynx Death rate Virus in organs Organ（PFU/ml）Immunized once 21 - 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） No Immunized twice 10 + 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） 0（0/5） No Control group 21 - 80%（4/5） 40%（2/5） 60%（3/5） 40%（2/5） Liver（102-3）

3 討論

流感病毒由于它的經(jīng)常變異性，針對當(dāng)前流行的流感病毒使用適時性的流感疫苗，對預(yù)防人類流感流行極為重要，目前使用的人類流感疫苗多為自然分離病毒株，包括：PR8、豬流感疫苗等。近10年來HPAIV株不斷造成人類死亡，但是不能使用自然分離的HPAIV病毒株作為疫苗株，原因如下：感染早期致雞胚死亡，不能產(chǎn)生高滴度病毒；在生產(chǎn)過程中，無法避免對制造者的威脅；生產(chǎn)制造需要P3等特殊設(shè)施及設(shè)備，造價太高。因此，人工合成能對抗HPAIV的適時性的流感病毒疫苗勢在必行。流感病毒反向遺傳技術(shù)，可以適時性的快速合成人工融合病毒，無疑是合成有針對性的流感病毒疫苗的有用方法之一。到目前為止，人類已經(jīng)合成包括HA3、HA5、HA7、HA9等外來基因的PR8融合病毒，但并大數(shù)多僅對其免疫性進行了探討［8，9，10］，有待于進一步深入探討研究。

本研究前期以流感病毒反向遺傳技術(shù)合成了人工融合病毒株rH5/PR8株，已經(jīng)驗證并報告了其增殖能力可以與自然分離的PR8病毒相比美，外來基因表達(dá)穩(wěn)定，且對自然宿主雞呈弱毒性。本次研究我們主要針對rH5/PR8的免疫性進行了研究：用免疫原有效性實驗、免疫原穩(wěn)定性實驗證明，免疫抗體順利增高，有效抗體持續(xù)時間長，室溫條件下放置保存未降低的免疫原性。提示人工合成的融合病毒株rH5/PR8株表面表達(dá)免疫抗原HA5數(shù)量充分，表達(dá)穩(wěn)定，不易被降解，符合疫苗株的要求。免疫后長時間的抗體水平觀察也為了解動物免疫抗體的上升，下降等動態(tài)水平變化提供了詳盡的數(shù)據(jù)。

免疫防御實驗是確認(rèn)疫苗株是否有效的直接證明實驗，以前多用鼠為實驗動物［11，12，13］，但在流感病毒感染生物鏈條中，鳥類扮演著重要角色。因此，本研究選用雞作為實驗動物，以HPAIV攻擊的對照組，雞的死亡率在60%，出現(xiàn)便血，皮下出血等嚴(yán)重臨床癥狀，臟器及咽喉部都有病毒增殖；相比之下HPAIV攻擊免疫組雞的死亡率為0，無明顯臨床癥狀，未從雞的咽喉液及臟器中分離到病毒，提示用rH5/PR8免疫后的雞對HPAIV100%免疫防御有效。在2010年最新的研究中，Nayak B等用病毒反向遺傳技術(shù)將H5N1型HPAIV的HA、NA、M2分別或同時組入 NewscastaleDisease virus（NDVs）病毒株，用攻擊實驗證實，HA單獨表達(dá)組有足夠的免疫防御能力，這與我們的研究結(jié)果相同；而NA、M2同時表達(dá)組可以延長生存時間不能增加生存率；M2表達(dá)組無免疫防御功能，因此，M2不是中和抗原［14］，該研究結(jié)果也間接支持我們使用HA表達(dá)的人工融合病毒作為疫苗株的正確性。Ma W等［15］用HPAIV的NS做為外來基因，合成的人工病毒株可以有效地防御H7N1的感染，NS蛋白功能不清，非中和抗原只出現(xiàn)于感染細(xì)胞內(nèi)，不存在于病毒顆粒內(nèi)，推論NS蛋白與誘導(dǎo)細(xì)胞免疫有關(guān)。有研究使用其他病毒作為載體，例如：用新城疫病毒代替PR8流感病毒，這樣可以使免疫動物“一箭雙雕”，但不適合于人類使用，同時由于僅能取向HA或NA，NS等1個或2個基因，不能完全覆蓋流感病毒體液免疫和細(xì)胞免疫防御。如果用流感病毒反向遺傳技術(shù)，合成具有當(dāng)前流行病毒的HA，NA，NS基因的人工融合病毒株，調(diào)動機體的體液免疫及細(xì)胞免疫兩方面因素，防御流行病毒的感染擴散可能是更為有效的防御途徑，也是將來流感病毒疫苗開發(fā)的方向之一。

綜上，本研究用流感病毒反向遺傳技術(shù)合成的人工融合病毒株rH5/PR8株，除了增殖能力不受影響、遺傳穩(wěn)定性好，對原宿主動物呈弱毒性外，其免疫原性可靠，持續(xù)時間長，免疫原穩(wěn)定，免疫防御有效，證明人工融合病毒株rH5/PR8株作為疫苗候選株是合格的，也為今后用流感病毒反向遺傳技術(shù)合成可用于臨床的人類的流感疫苗病毒株提供了可靠的數(shù)據(jù)。

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（編輯 孫憲民，英文編輯 陳 姜）

Immunological Characteristics of Syncytial Virus Strain rH5/PR8Generated by Reverse Genetics System for Influenza Virus

QIAOYing，CAINa，WENQing-hua，CAIXin-ze，HANXiao-xu，ZHAOLian-shuang，SHANGHong
（Central Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the immunological characteristics of the syncytial virus strain rH5/PR8generated by plasmid-based reverse genetics system for influenza virus，and to provide evidence for the immunity，effectiveness，stability，and persistence of the virus as a vaccine candidate.MethodsrH5/PR8，an attenuated influenza virus strain，was generated by plasmid-based reverse genetics system.Animal experiment was performed to confirm the immunity，stability，and immune defense of the virus.ResultsThe transfectant influenza virus strains of rH5/PR8were all generated from A/PR/8/34（PR8）except for HA，which was from highly pathogenic avian influenza virus（HPAIV）H5N1with the removal of basic amino acid（RKKR）motif in the connecting peptide from 346to 349.The mean HItiter of antibody from chickens immunized with inactivated rH5/PR8was over 29and lasted for 2months.The immunogen was kept for 2to 4months and used in repeated experiments.In repeated experiments，the antibody level was similar，and the effective antibody level lasted for over 7months after immunized，which indicated that HA5antigen of rH5/PR8virus was stable.The immune defense showed that the mortality of the chickens reached 60%in non-immune group，while none died in immune group，suggesting that the immune defense was effective.Conlusion The exogenous gene HA5from influenza virus rH5/PR8generated by plasmid-based reverse genetics system has reliable immunogenicity and stable antigenicity.The antibody level can last for a long time，indicating an effective immune defense.

reverse genetics；influenza；highly pathogenic avian influenza virus；vaccine

O657.72；Q523

A

0258-4646（2010）11-0891-04

教育部留學(xué)歸國啟動基金［教外司留（2009）8］

喬瑩（1962-），女，講師，博士.

尚紅，E-mail：hongshang100@hotmail.com

2010-09-02