云南馬關(guān)塘房桔炭疽病的病原分離和鑒定

張玉潔

(1.文山學(xué)院生化系,云南文山 663000;2.文山州生物資源開發(fā)研究中心,云南文山 663000)

塘房桔是近年來在云南省馬關(guān)縣境內(nèi)選出并大量推廣種植的晚熟鮮食柑桔品種,春節(jié)前 1～2個(gè)月成熟。該品種果實(shí)扁圓形,平均單果重 20 g,最大果重 49 g。成熟后顏色鮮黃、皮薄緊繃、清香味濃,是當(dāng)?shù)靥赜衅贩N。近十年來,塘坊桔已成為云南省馬關(guān)縣調(diào)整農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中一個(gè)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn),至 2007年底塘房桔的種植面積發(fā)展到 8 767畝,總產(chǎn)量達(dá) 950噸,總產(chǎn)值達(dá) 344萬元。隨著種植規(guī)模的迅速發(fā)展和種植時(shí)間的延長(zhǎng),原來的粗放管理改為園藝式的集約化栽培。由于栽培生態(tài)的變化和感病寄主的增加,致使塘房桔病害逐年加重。自 2007～2008年始柑桔炭疽病大規(guī)模流行。該病春季危害幼葉和幼果,夏、秋季節(jié)侵害各階段果實(shí)和葉子,導(dǎo)致大面積落葉、落果、形成空枝,產(chǎn)量急劇下降,整個(gè)地區(qū)塘房桔產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重影響,2008年較上年減收約 200萬元,而且有逐年惡化的趨勢(shì),成為生產(chǎn)上亟待解決的難題。2009年下半年,筆者對(duì)塘房桔炭疽病進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,報(bào)道了病原菌的分離鑒定結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 病原分離

供試分離的塘房桔樣品隨機(jī)采自馬關(guān)塘房村的幾個(gè)桔園,共選 33個(gè)病果,采用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)進(jìn)行組織分離培養(yǎng)。具體方法:取桔子典型病斑周圍具有菌絲擴(kuò)散的組織,依次用 70%乙醇和 0.1%升汞進(jìn)行表面消毒后置 PDA平板上培養(yǎng),獲得來自病理組織的各種菌株。采用單孢分離法純化分離的菌株,記錄并統(tǒng)計(jì)各菌株出現(xiàn)頻率,編號(hào)后轉(zhuǎn)管于 PDA培養(yǎng)基,保存在 4℃冰箱內(nèi)待鑒定。

1.2 菌株的促孢和擴(kuò)繁及孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察鑒定

將純化的菌株分別轉(zhuǎn)接于各種類型促孢培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5～7 d后,無菌刮除表層氣生菌絲,然后用滅菌的毛刷蘸無菌水涂刷在底層菌絲表面,置 25～28℃,12 h光照黑暗交替的環(huán)境中培養(yǎng),促使其產(chǎn)生大量孢子供鏡檢鑒定和回接實(shí)驗(yàn)用。菌種鑒定參考真菌鑒定手冊(cè)[1-4]。

1.3 回接和病原菌株的確定

利用健康無損的生長(zhǎng)期果子,使用傷口接種和噴霧接種兩種方法,各菌株接 3～5個(gè)健康柑桔果子。傷口接種方法是先進(jìn)行桔子表面消毒,用無菌水沖洗后,用接種針在桔子皮上扎一個(gè)直徑 0.15 mm的小孔,孔處接種孢子或菌絲片段的懸液后用塑料膜套上,保濕 3 d后去膜,在自然條件下發(fā)病。噴霧接種是將孢子或菌絲片段懸浮液直接噴于健康果子上,其他操作同傷口接種。接種后每 2 d觀察 1次,記載發(fā)病果數(shù)和癥狀,待充分發(fā)病后,取典型病果進(jìn)行再分離。

2 結(jié)果和分析

2.1 自然發(fā)病桔林的典型癥狀

該病原致病性很強(qiáng),病害從春季開始顯癥,首先侵害幼葉。幼果長(zhǎng)出后侵害幼果,此后可侵害各階段果子和葉子,使葉子、果子大量脫落形成空枝。病害侵害葉子,初為黃色沿葉脈擴(kuò)散形成不規(guī)則病斑,后使局部甚至大半個(gè)葉子枯死 (圖 1);病菌侵害果子,病斑初為黃色或橙色、邊緣不整齊、形狀不規(guī)則的小病斑,后擴(kuò)大成圓形,黑紅色病斑中間凹陷,大小為 3～10 mm,病斑周圍有黃色暈圈為菌絲擴(kuò)散 (圖 2)。病害不侵害果肉,但病果、葉子大量脫落。染過病的果子味苦難以食用。

圖1 葉子病斑形態(tài)

圖2 果皮典型病斑形態(tài)

2.2 菌株分離和初步鑒定結(jié)果

通過 33個(gè)典型病果的病斑組織分離獲得 45個(gè)分離物,依培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征初步歸屬于 5個(gè)真菌分類單位 (見表 1)。5個(gè)菌株中,分離頻率最高的是細(xì)交鏈孢菌 (A lternaria tenuis),分離頻率為97.8%;莖點(diǎn)霉屬 1種 (Phom asp.)分離頻率為91.1%;刺盤孢屬 (Colletotrichumsp.)1株,分離頻率為 88.9%;一種在常規(guī)培養(yǎng)下未能誘導(dǎo)產(chǎn)孢的菌株的分離頻率為 73.3%,曲霉屬 1種 (Aspergillussp.)分離頻率為 26.7%;鐮刀菌屬 1種 (Fusicoccumsp.)分離頻率為 11.1%。

表1 柑桔褐斑病病理組織真菌分離頻率

2.3 病原菌株的確定

回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,只有果 1-歌 1株可以誘導(dǎo)健康果子產(chǎn)生典型病斑,而且致病性非常強(qiáng)。傷口接種病原后保濕三天可見周圍邊緣染病褐變,7天后出現(xiàn)明顯的圓形褐斑,其癥狀表現(xiàn)和典型癥狀相似,并可從病斑處分離到此菌,可確定是該病的病原菌。鐮刀菌接種可使果子腐爛,但不表現(xiàn)典型病斑;其它菌株均無明顯病斑產(chǎn)生。噴霧接種發(fā)病遲于傷口接種。

2.4 病原菌的培養(yǎng)性狀、測(cè)微和鑒定

果 -歌在 PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速,新生菌絲白色,沿培養(yǎng)基向四周擴(kuò)展很快;后期菌絲變成灰綠色、鼠灰色,菌絲體茂密 (圖 3)。黑暗培養(yǎng)一周后,刮除氣生菌絲并用毛刷刷無菌水于基內(nèi)菌絲表面,再行光照黑暗交替培養(yǎng)可產(chǎn)生大量分生孢子,全黑暗培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期培養(yǎng)不產(chǎn)孢。分生孢子器球形,黑褐色或黑色,單質(zhì)或碳質(zhì),散生在培養(yǎng)基表層。分生孢子梗無。分生孢子器近乎球形,有 1孔口,壁革質(zhì)至炭質(zhì),黑色。分生孢子器直徑 83.74～109.22μm,孔口直徑 19.3～34.1μm (圖 4)。分生孢子長(zhǎng)圓形,兩端各有油球 1個(gè),孢子大小為5.3～8.2μm ×1.6～2.3μm。根據(jù)以上特征,該病原分類地位為半知菌亞門刺盤孢 (Colletotrichumsp.)真菌[1-4],其種名有待進(jìn)一步確定。

圖3 接種于 PDA平板培養(yǎng) 3d的菌落形態(tài)

圖4 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) (400×)

3 結(jié)論與討論

分離的菌株進(jìn)行傷口和噴霧接種發(fā)病癥狀與典型癥狀進(jìn)行比較,結(jié)果證明,導(dǎo)致此柑桔炭疽病大規(guī)模流行的病原菌為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)真菌,為強(qiáng)致病性,其種名有待進(jìn)一步確定。從分離頻率看,極細(xì)鏈隔孢菌(Alternaia tenuis)高于Colletotrichumsp.,但經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證,A.tenuis不導(dǎo)致塘房桔果子發(fā)病。但A.tenuis有如此高的分離頻率,可以認(rèn)為A.tenuis是塘房桔果內(nèi)一種內(nèi)生菌。很多報(bào)道顯示A lternaiasp.為致蘋果、冬棗等黑斑病的病原菌[5-7],而A.tenuis卻不能使塘房桔發(fā)病,或許此桔子品種對(duì)A.tenuis有較強(qiáng)的抗病性。

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