廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠調(diào)血脂作用及其機(jī)制的研究

汪正廣， 吳常青， 汪春彥， 江 勤， 董六一*

(1.抗炎免疫藥理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽合肥230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230032)

高脂血癥可加速心、腦等器官的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)，引起冠心病、心肌梗死等疾病，故降低血脂是防治心腦血管病的有效措施［1］。廣玉蘭(Magnolia grandifore)又名荷花玉蘭、洋玉蘭，系木蘭科木蘭屬喬木樹種。其葉及花中含有揮發(fā)油、木蘭花堿等多種化學(xué)成分，藥理實(shí)驗(yàn)表明對(duì)正?；蚵樽頎顟B(tài)下的動(dòng)物均有緩慢的降壓作用［2-3］。其葉乙酸乙酯提取物中還含有黃酮類和酚類化合物，具有顯著的抗氧化活性［4］。廣玉蘭油系從其種子中提取的含有多種不飽和脂肪酸、黃酮類及酚類化合物，本研究以高脂血癥大鼠模型為研究對(duì)象，探討廣玉蘭油的調(diào)血脂作用及其作用機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂性清潔級(jí)SD大鼠，體重200～220 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。

1.2 藥品及試劑 廣玉蘭油:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院提供(每1mg廣玉蘭油相當(dāng)于8.9mg生藥量)，批號(hào):20090315;辛伐他汀:廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號(hào):20090101;膽固醇(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)060920);丙硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào) 060901);膽酸鈉(Sigma公司，批號(hào)066K1704);TG，TC，HDL-C，LDL-C 測(cè)定試劑盒:長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào):20090518;SOD，GSH-Px，MDA試劑盒:南京建成生物工程研究所，批號(hào):20090521。PON1(ELISA)試劑盒:上海滬峰生物科技有限公司，批號(hào):20090515。

1.3 儀器 756P紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);HH-420S數(shù)顯恒溫水箱(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠);TGL-16H高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品);FA/JA電子天平(上海精天電子儀器有限公司);SpectraMax 190酶標(biāo)儀:Molecular Devices，USA;JEDR801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)Version6.0:捷達(dá)科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠脂代謝紊亂模型

2.1.1 動(dòng)物模型的建立 上述SD大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，一組作為正常對(duì)照組(10只)，另外一組作為造模組(70只)，2組均給予基礎(chǔ)飼料。參照文獻(xiàn)方法［5-6］制備高脂乳劑。造模組每天上午灌胃給予高脂乳劑0.01 mL/g體重，同時(shí)正常組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)用至第10天時(shí)，各組動(dòng)物斷尾取血，測(cè)血清TC，以造模組血清TC顯著高于正常組為確定造模成功的指標(biāo)。造模處理后，從模型組共選出50只造模成功的大鼠，即高脂血癥大鼠。

2.1.2 分組給藥及標(biāo)本處理 除正常對(duì)照組外，模型組中高脂血癥大鼠隨機(jī)分為5組(每組10只)，分別為:模型組，辛伐他汀對(duì)照組(陽性藥組)，廣玉蘭油50、100、200 mg/kg 3個(gè)劑量組。每天下午，正常組和模型組給等體積的飲用水，廣玉蘭油各劑量組分別給予廣玉蘭油50、100、200 mg/kg，陽性藥組給予辛伐他汀20 mg/kg，連續(xù)灌胃給藥20d。給藥過程中，除正常組外，其余各組上午繼續(xù)給予高脂乳劑(0.01mL/g)灌胃。每周稱體重1次，隨體重調(diào)整給藥量。末次給藥后，禁食12 h，烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。取大鼠胸主動(dòng)脈和肝臟部分組織，用10%福爾馬林液固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察血管上As病變及肝臟病理組織學(xué)變化，并依據(jù)通用半定量肝臟病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］，對(duì)肝臟損傷進(jìn)行積分，病理積分標(biāo)準(zhǔn)如下:肝臟水樣變性積1.0分，脂肪樣空泡形成積2.0分，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)積1.0分，嗜酸性變積1.0分，壞死積3.0分。

2.1.3 指標(biāo)測(cè)定 采用氧化酶法測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C;采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清SOD的含量，硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定血清MDA的含量，采用ELISA法測(cè)定血清中PON1的活性。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響 與正常組相比，模型組TC、TG、LDL-C均顯著升高(P＜0.01)，HDL-C顯著下降(P＜0.01);與模型組相比，辛伐他汀組與廣玉蘭油中，高劑量組均能顯著降低高脂血癥大鼠TC、TG、LDL-C(P＜0.05或P＜0.01)，顯著升高HDL-C(P＜0.01)。提示廣玉蘭油具有顯著的降低血脂的作用，見表1。

表1 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠血清脂質(zhì)水平的影響(±s，n=8)

表1 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠血清脂質(zhì)水平的影響(±s，n=8)

與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量/(mg/kg) TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) HDL/(mmol/L) LDL/(mmol/L)正常對(duì)照組-0.79±0.49 3.94±0.90 3.09±0.41 0.17±0.04模型對(duì)照組 - 1.43±0.30△△ 18.50±5.28△△ 0.94±0.17△△ 7.21±2.29△△廣玉蘭油 200 0.83±0.35** 8.36±4.60** 2.40±0.60** 4.53±2.29*100 1.08±0.59** 10.47±7.70* 2.80±0.83** 6.43±2.85 50 1.30±0.34 13.71±5.86 2.52±0.80** 5.64±2.90辛伐他汀 20 1.07±0.42** 12.11±4.99* 2.04±0.61** 2.46±1.17**

3.2 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠血清PON-1、SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中PON-1、SOD和GSH-Px活力明顯下降(P＜0.01)，血清中MDA含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，辛伐他汀組，廣玉蘭油組均能顯著升高血清中PON-1、SOD和GSH-Px活力(P＜0.05或P＜0.01)，顯著降低血清中MDA含量(P ＜0.05)，見表2。

表2 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠血清中PON-1、SOD和GSH-Px活性及MDA含量的影響(±s，n=8)

表2 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠血清中PON-1、SOD和GSH-Px活性及MDA含量的影響(±s，n=8)

與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑 量/(mg/kg) PON-1/(IU/mL) SOD/(kU/L) GSH-Px/(kU/L) MDA/(μmol/L)正常對(duì)照組-560.4±64.7 61.6±3.5 384.0±44.9 5.65±1.63模型對(duì)照組 - 240.6±61.8△△ 54.5±6.3△△ 299.1±80.0△△ 8.93±2.64△△廣玉蘭油 200 558.7±79.0** 60.9±2.2* 414.7±41.6** 6.29±1.38*100 444.7±119.6** 57.4±5.0 483.7±48.0** 6.76±1.46*50 366.9±82.6* 58.6±3.5 409.0±30.6** 6.69±1.55*辛伐他汀 20 367.4±114.8* 62.7±2.5* 433.6±59.8**7.56±0.89

3.3 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠肝臟的保護(hù)作用正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，呈放射狀，肝竇正常，胞核結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠肝細(xì)胞普遍發(fā)生脂肪變性，肝細(xì)胞腫大變圓，胞漿疏松，內(nèi)含大的脂肪滴，中央靜脈周圍或匯管區(qū)灶性脂變及成片組織脂變，少數(shù)可見有肝細(xì)胞碎屑樣壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn);廣玉蘭油組和辛伐他汀組的肝脂肪變性程度明顯減輕，脂滴數(shù)量減少，肝細(xì)胞體積變小，脂肪空泡顯著減小。肝臟損傷積分結(jié)果顯示，廣玉蘭油各劑量組和辛伐他汀組與模型對(duì)照組比較均差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，見表3。

3.4 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈組織病理學(xué)的影響 光鏡下可見，正常對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，內(nèi)膜連續(xù)光滑，中層平滑肌層均勻無萎縮;模型組大鼠胸主動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮脫落，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮下間隙增寬，內(nèi)彈力板斷裂，斑塊內(nèi)含有大量泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，纖維組織增生，中膜平滑肌明顯萎縮;廣玉蘭油組及辛伐他汀組可見血管內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，結(jié)構(gòu)較完整，有少量脂質(zhì)沉積，少見內(nèi)彈力板斷裂(見圖1)。提示廣玉蘭油對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有一定的抑制作用。

表3 各組高脂血癥大鼠肝臟組織損傷積分表(±s，n=8)

表3 各組高脂血癥大鼠肝臟組織損傷積分表(±s，n=8)

與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/(mg/kg)肝組織損傷積分正常對(duì)照組--模型對(duì)照組 - 6.13±1.25廣玉蘭油 200 3.75±1.04**100 4.13±0.83**50 4.63±1.41*辛伐他汀 20 3.63±1.19**

圖1 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈病理組織學(xué)的影響(HE染色)

3.5 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠對(duì)肝臟組織TNF-α蛋白表達(dá)的影響 TNF-α蛋白陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿或胞核呈棕黃色或深棕黃色顆粒。與正常對(duì)照組比較，模型組肝臟組織中TNF-α蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01)。廣玉蘭油各劑量組和辛伐他汀組肝臟組織中TNF-α蛋白表達(dá)較模型組顯著減少(P＜0.01或 P ＜0.05)。見圖2、3。

圖2 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織中TNF-α蛋白表達(dá)的影響(免疫組化染色，×40)

圖3 廣玉蘭油對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織中TNF-α蛋白表達(dá)的影響

4 討論

高脂血癥是中老年人的常見病、多發(fā)病，由體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂所致，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心腦血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［8］。高脂血癥和脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)［9］，血脂升高使機(jī)體自由基產(chǎn)生和清除平衡被破壞，大量的氧自由基可減弱脂蛋白脂酶的活性、升高TG和降低HDL，進(jìn)一步加重脂質(zhì)代謝紊亂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，廣玉蘭油能明顯降低高脂血癥大鼠TC，TG，LDL-C，升高 HDL-C，并顯著降低高脂血癥大鼠血清 MDA水平、升高血清中 PON-1，SOD和GSH-Px酶的活性;另外，廣玉蘭油能明顯改善脂肪肝損傷和主動(dòng)脈血管粥樣硬化病變，提示廣玉蘭油可有效糾正高脂血癥動(dòng)物的脂質(zhì)代謝紊亂、脂肪肝和血管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，這可能與廣玉蘭油通過提高機(jī)體抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

血清脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可誘導(dǎo)炎癥因子及炎癥反應(yīng)［10］，TNF-α 作為一種細(xì)胞因子，在正常情況下主要是由脂肪組織產(chǎn)生，有研究表明，TNF-α是脂肪肝發(fā)生發(fā)展中一個(gè)關(guān)鍵的因子［11］。當(dāng)肝內(nèi)的游離脂肪酸增多，游離脂肪酸可通過加強(qiáng)TNF-α等細(xì)胞因子的毒性，引起線粒體功能不全，肝細(xì)胞損傷［12］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，廣玉蘭油能明顯降低高脂血癥大鼠肝組織TNF-α的表達(dá)，降低炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，延緩脂肪肝的進(jìn)程。

總之，廣玉蘭油能明顯調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，減少動(dòng)脈粥樣硬化病變及脂肪肝的發(fā)生，其調(diào)血脂機(jī)制可能與提高抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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