女金丸薄層色譜鑒別方法研究

戴 敬， 楊曉婧， 郝培培， 馮 麗， 李建晨

(1.河北省藥品檢驗所，河北石家莊050011;2.河北科技大學(xué)，河北石家莊050018)

女金丸系由當(dāng)歸、白芍、肉桂、益母草、牡丹皮、延胡索、黃芩、陳皮等二十三味中藥制成的大蜜丸或水蜜丸，具益氣養(yǎng)血，理氣活血，止痛之功效，用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)［1］340。女金丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2005年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中僅有丹皮酚、桂皮醛和黃芩苷3項薄層色譜鑒別，并且鑒別方法尚不完善，如丹皮酚的鑒別前處理方法較難操作;桂皮醛的鑒別采用的展開劑含因毒性較大而被禁用的溶劑苯，黃芩苷的鑒別重現(xiàn)性較差等問題，因此我們對女金丸的薄層鑒別方法進(jìn)行了研究，不僅對現(xiàn)有鑒別進(jìn)行了改進(jìn)和完善，還研究建立了白芍、益母草、延胡索、陳皮的薄層色譜鑒別方法。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

瑞士CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng)。

1.2 對照品、對照藥材

均由中國藥品生物制品檢定所提供:丹皮酚(批號:0708-9704)，桂皮醛(批號:111710-200513)，黃芩苷(批號:110715-200514)，芍藥苷(批號:0736-200219)，鹽酸水蘇堿(批號:110712-200508);延胡索(批號:120928-200604)，黃芩(批號:120955-200406)，陳皮(批號:120969-200406)。

1.3 女金丸樣品

大蜜丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(批號:4013142、7013422、6013332)、哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠(批號:0708141、0709104)、河北世濟(jì)唐威藥業(yè)有限公司(批號:20070526)、包頭中藥有限責(zé)任公司(批號:071113)、亞寶藥業(yè)大同制藥有限公司(批號:20070123)提供;水蜜丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(批號:8035235 25)、黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司(批號:20071103、20071104、20071105)、吉林雙士藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號:081001、081101、081102)、西安自力藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號:20060701、20060702)提供。各陰性對照樣品根據(jù)處方及制法自制。

1.4 試劑

大孔吸附樹脂60～16目，D-101凈品型，天津市海光化工有限公司生產(chǎn);聚酰胺100～200目、聚酰胺薄膜均由浙江省臺州市陸橋四甲生化塑料廠生產(chǎn);中性氧化鋁100～200目上海五四化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);活性炭天津市紅巖化學(xué)試劑廠生產(chǎn);732陽離子交換樹脂國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);其他試劑均為分析純。

1.5 硅膠G預(yù)制薄層板

青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1丹皮酚的TLC鑒別

取本品水蜜丸10 g，研碎;或取大蜜丸18 g，剪碎。置500 mL圓底燒瓶中，加水200 mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水至刻度并溢流入燒瓶時為止，再加入石油醚(60～90℃)1 mL，連接回流冷凝器，加熱并保持微沸1 h，放冷，取石油醚層作為供試品溶液。另取丹皮酚對照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液-鹽酸(50∶1)。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。牡丹皮與白芍陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖1)。

圖1 丹皮酚TLC鑒別照片

2.2 桂皮醛的TLC鑒別

取2.1項下的供試品溶液作為供試品溶液。另取桂皮醛對照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含0.5 μL的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液5 μL、對照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17 ∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，放置至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。肉桂陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖2)。

圖2 桂皮醛TLC鑒別照片

2.3 延胡索的TLC鑒別

取本品水蜜丸10 g，研碎，加氨水5 mL;或取大蜜丸18 g，剪碎，加硅藻土10 g，研勻，加濃氨溶液10 mL，密塞，振搖，放置10 min，加三氯甲烷60 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約10 mL，移置分液漏斗中，用0.5 mol/L的鹽酸溶液振搖提取2次，每次10 mL，合并酸溶液，加濃氨溶液5 mL(使pH值11以上)，用三氯甲烷振搖提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘渣加三氯甲烷溶解使成0.5 mL，作為供試品溶液。另取延胡索對照藥材0.5 g，加濃氨溶液0.5 mL，振搖，放置10 min，加三氯甲烷20 mL，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液10～20 μL、對照藥材溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)。延胡索陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖3)。

圖3-A 延胡索TLC鑒別照片

2.4 黃芩TLC鑒別

圖3-B 延胡索TLC鑒別照片

取本品水蜜丸5 g，研碎;或取大蜜丸9 g，剪碎，加硅藻土5 g，研勻，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，用脫脂棉濾過，濾液加于D101型大孔吸附樹脂柱(16～60目，內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為15 cm)上，流速為1.0～1.5 mL/min，依次以水、30%乙醇各50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加50%乙醇5 mL溶解，加于聚酰胺柱(100～200目，1 g，內(nèi)徑為1 cm，用水濕法裝柱)上，用50%乙醇10 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，備用，繼用乙醇10 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，搖勻，靜置，取上清液作為對照藥材溶液。再取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。黃芩陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖4)。

圖4-A 黃芩TLC鑒別照片

圖4-B 黃芩TLC鑒別照片

2.5 陳皮的TLC鑒別

取2.4項下備用的聚酰胺柱50%乙醇洗脫液，在水浴上蒸除乙醇，加水至約5 mL，移置分液漏斗中，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次5 mL，合并乙酸乙酯液(水溶液備用)，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，搖勻，靜置，取上清液作為對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(28∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105℃加熱5 min，放冷，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陳皮陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖5)。

圖5-A 陳皮TLC鑒別照片

圖5-B 陳皮TLC鑒別照片

2.6 芍藥苷的TLC鑒別

取2.5項下乙酸乙酯提取后的水溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次8 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇5 mL分次溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm，干法裝柱)上，用80%甲醇20 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶18 ∶10)10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。白芍與牡丹皮陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖6)。

圖6-A 芍藥苷TLC鑒別照片

圖7-A 益母草TLC鑒別照片

圖6-B 芍藥苷TLC鑒別照片

圖7-B 益母草TLC鑒別照片

2.7 鹽酸水蘇堿TLC鑒別

取本品水蜜丸5 g，研碎;或取大蜜丸9 g，剪碎，加水60 mL，攪拌使溶散，微沸回流30 min，放冷，離心，取上清液，加稀鹽酸調(diào)pH至1～2，離心，取上清液，濾過，濾液通過已處理好的732陽離子交換樹脂柱(粒度為0.3～1.2 mm，內(nèi)徑為10 mm，柱高為15 cm)，流速為1.0～1.5 mL/min，以水洗至洗脫液近無色，棄去洗脫液，再以氨水溶液(15→100)30 mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加80%乙醇10 mL分次溶解，加于活性炭-中性氧化鋁柱(活性炭100目以上，0.3 g;中性氧化鋁100～200目，2 g;混勻，裝柱，內(nèi)徑為15 mm)上，用80%乙醇20 mL洗脫，收集流出液與洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-鹽酸-乙酸乙酯(8 ∶3 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干12 h以上，噴以稀碘化鉍鉀試液，放置2～3 h，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。益母草陰性對照無干擾，方法具專屬性(見圖7)。

3 討論

3.1 本實驗建立了處方藥味牡丹皮與白芍所含丹皮酚的TLC鑒別方法。該方法供試品溶液制備采用揮發(fā)油提取法，避免了硅藻土研磨操作和大量有機(jī)溶劑的使用，達(dá)到簡化操作，環(huán)保的目的。采用氫氧化鈉改性硅膠G板進(jìn)行薄層層析，可以充分消除雜質(zhì)的干擾。

3.2 由于桂皮醛與丹皮酚的理化性質(zhì)相似，故桂皮醛的鑒別采用與丹皮酚鑒別相同的供試品溶液。2005版中國藥典采用的展開劑含有因毒性較大目前被禁用的溶劑苯，所以我們經(jīng)實驗改變了展開劑的種類和配比，使用毒性較小的溶劑替代了苯。顯色時，斑點(diǎn)隨放置時間延長而加深，以放置0.5～1 h后觀察為宜。

3.3 延胡索的主要成分是生物堿類使用氫氧化鈉改性的硅膠G板進(jìn)行薄層層析，可有效改善斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象，展開后的薄層板噴顯色劑后，可覆蓋同樣大小的玻璃片放置一定時間，板面背景顏色會逐漸變淺，會利于觀察斑點(diǎn)顯色情況。

3.4 大孔吸附樹脂柱洗脫溶劑考察結(jié)果表明水和30%乙醇洗脫液中不含黃芩苷，50%乙醇和70%乙醇洗脫液中均含有黃芩苷，故以70%乙醇洗脫。聚酰胺柱洗脫溶劑考察結(jié)果表明50%乙醇洗脫液不含黃芩苷，70%乙醇和乙醇洗脫液中均含黃芩苷，故以乙醇洗脫。曾試用展開劑乙酸乙酯-甲酸(6∶1)，雖然色譜斑點(diǎn)較圓整，但由于陰性有干擾而無法采用，故選用36%醋酸為展開劑。采用黃芩苷對照品與黃芩對照藥材同時作對照，可以獲得較多的鑒別信息。

3.5 陳皮的供試品溶液制備采用聚酰胺柱50%乙醇洗脫部分，再經(jīng)乙酸乙酯萃取制得。由于橙皮苷對照品較難溶解，故以陳皮對照藥材作對照，對照藥材制備方法也較簡便，薄層色譜結(jié)果令人滿意。

3.6 芍藥苷供試品溶液采用鑒別陳皮時用乙酸乙酯提取后剩下的水溶液經(jīng)正丁醇萃取制得，可以減少檢驗樣品用量并簡化操作。使用硅膠G薄層板進(jìn)行薄層層析，結(jié)果空白對照色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯同樣的淡紅色斑點(diǎn)，陰性有干擾。改用氫氧化鈉改性的硅膠G薄層板進(jìn)行薄層層析，可以充分消除陰性的干擾，提高了方法的專屬性。曾試用展開劑三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40 ∶5 ∶10

∶0.2)和三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10)10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，因色譜結(jié)果均不理想而未予采用。

3.7 益母草供試品溶液的制備采用了732強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂選擇性吸附生物堿，達(dá)到與糖、蜜等水溶性成分分離目的。再經(jīng)活性炭-中性氧化鋁柱進(jìn)一步凈化除雜，供試液點(diǎn)樣容易，色譜結(jié)果無背景，斑點(diǎn)清晰。曾試用展開劑醋酸乙酯-無水乙醇-甲酸(3 ∶2 ∶2)、丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)，因色譜結(jié)果均不理想而未予采用。噴顯色劑后開始斑點(diǎn)較淡，放置約2～3 h更容易觀察。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集(第一冊)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:262.