制備型高效液相色譜法制備和厚樸酚與厚樸酚

劉 霞， 唐驍爽， 汪永強， 葛紅麗， 呂海燕， 唐玉海，*

(1.西安交通大學理學院分析科學研究所，陜西西安710061;2.蘭州大學第二醫(yī)院，甘肅蘭州730030;3.中科院成都生物所，四川成都610041)

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.ed Wils.var.biloba Rehd.Et Wils.的干燥干皮，枝皮或根皮，主要化學成分為和厚樸酚與厚樸酚，約占原藥材的5% ～12%。和厚樸酚與厚樸酚均具有抗菌、抗炎［1］，抗氧化作用［2］，此外，厚樸酚還具有抗抑郁作用［3］，而和厚樸酚(0.1 ～10 μmg/kg)對大鼠皮質神經元具有營養(yǎng)作用，10 μmg/kg和厚樸酚的營養(yǎng)神經的活性與40 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的活性相似［4］。

二者系同分異構體，很難分離，本文采用溶劑提取法，利用硅膠柱色譜純化技術分離得到了4-O-methylhonokiol與和厚樸酚、厚樸酚混合物，再采用制備型高效液相色譜法分離純化和厚樸酚與厚樸酚混合物，運用分析型HPLC測定純度，所得產品純度均大于95%。此方法具有快速、高效、產品純度高的特點，可大量制備和厚樸酚與厚樸酚，對于科學研究、臨床前和臨床試驗具有非常重要的意義，也可制備和厚樸酚與厚樸酚對照品的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

制備型液相色譜儀;qingqq;旋轉蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠);甲醇(色譜純;Fisher Scientific);硅膠G(100～200目，青島海洋化工有限公司);厚樸藥材(陜西西安華陽生物科技有限公司);厚樸酚、和厚樸酚對照品(中國生物制品檢驗鑒定所)。

1.2 色譜條件

分析條件:Akasil-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-水-冰醋酸(80 ∶20 ∶0.10，V/V/V);流速:0.8 mL/min;檢測波長:294 nm;進樣量:20 μL。

制備條件:Wellchrom K-1800泵;LabAlliance Model 500可變波長檢測器;自填 C18柱(50 mm ×300 mm，10 μm);流動相甲醇-水-冰醋酸(80 ∶20 ∶0.10，V/V/V);流速80 mL/min;檢測波長294 nm;進樣量5 mL(六通閥進樣)。

1.3 厚樸中酚類化合物的提取

稱取厚樸粗粉50 g，90%甲醇回流提取，減壓濃縮，加入2%NaOH溶液，攪拌，靜置，過濾，在濾液中加2.0 mol/L的鹽酸調pH值至1～2，靜置，過濾。用少量氯仿溶解過濾得的沉淀，過硅膠柱(柱層析用，100～200目，柱長約45 cm，內徑2.5 cm)，以每10 mL洗脫液分段接收。薄層色譜定性每段接受液，減壓濃縮。得到淡黃色油狀化合物以及和厚樸酚與厚樸酚的混合物。

1.4 樣品制備色譜分離

加甲醇溶解和厚樸酚與厚樸酚混合物，采用制備型HPLC進行分離純化，多次進樣，根據(jù)色譜圖手動收集各色譜峰組分，減壓濃縮，析出結晶，真空干燥。圖1為和厚樸酚與厚樸酚混合物的制備色譜圖。

圖1 樣品的制備色譜圖

2 結果與討論

2.1 厚樸粗提物的硅膠柱色譜純化

根據(jù)厚樸中酚類化合物具有弱酸性，采用堿溶解酸沉淀的方法純化甲醇提取液，主要含有和厚樸酚、厚樸酚、以及一個未知物化合物，峰面積歸一化法測得三者的含量百分比分別為25.33%、48.51%、15.88%(圖2 A)。采用硅膠進一步分離純化，得到淡黃色油狀物，峰面積歸一化法測得其純度約為95%(圖2 B)，以及厚樸酚與和厚樸酚混合物，含量百分比分別為28.94%、63.82%，(圖2 C)所示。

2.2 制備色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 制備色譜流速的選擇

制備色譜條件由高效液相色譜分析條件擴展而來，當分析型與制備型液相色譜用填料相同，分析型液相色譜向制備型液相色譜轉化時，采用放大公式(式中Xp為制備型色譜流速，Xa為分析型色譜流速，rp為制備型柱半徑，為ra分析型柱半徑，CL為制備型色譜柱與分析型色譜柱的長度之比)［5］，制備色譜的理論流速為113 mL/min。當流速為113 mL/min時，和厚樸酚與厚樸酚很快的被洗脫出來，但是泵壓很大，分辨率低，兩者的分離效果均不佳，產品純度低。在此基礎上，優(yōu)化最佳流速，選擇流速為80 mL/min。

圖2 A堿溶解酸沉淀后的粗提物色譜圖 B未知化合物的純度測定色譜圖 C硅膠純化后含和厚樸酚與厚樸酚的色譜圖

2.2.2 最佳進樣體積、進樣量的優(yōu)化

根據(jù)粗品溶解性能，實驗選擇甲醇為溶劑，確定制備樣品質量濃度為10 mg/mL，觀察進樣體積對色譜分辨率影響，隨著進樣體積增大，色譜分辨率逐漸降低，色譜峰發(fā)生擴散，當進樣體積大于8 mL時，色譜分辨率急劇下降，且出現(xiàn)嚴重的峰形不對稱。當進樣體積越大，餾分中和厚樸酚、厚樸酚的純度降低。因此，選擇進樣體積為5 mL。在5 mL進樣體積的情況下，隨著進樣量的增大，色譜峰變寬，組分峰重疊情況加劇，容量因子K′逐漸減小，分辨率降低，在柱中會有樣品殘留，影響下一次的分離。因此，選擇最佳進樣量為10 mg/mL。

2.3 產品的定性分析及純度檢測

2.3.1 硅膠分離得淡黃色油狀化合物的結構鑒定

未知化合物:1H-NMR(400 MHz，CDCl3):δ ppm 3.35(2H，d，aryl-CH2-)，3.44(2H，d，aryl-CH2-)，3.90(3H，s，-OMe)，5.05-5.20(4H，m，2 ×-C=CH2)，5.94-6.07(2H，m，2× -CH=C)，6.91(1H，d，Ar-H)，6.98(1H，d，Ar-H)，7.05-7.08(2H，m，ArH)，7.24-7.31(2H，m，ArH).13C NMR(400MHz，CDCl3):δ ppm:34.2(C-7)，39.3(C-7′)，55.5(OMe)，110.9(C-3′)，115.4(C-4′)，115.5(C-9)，115.7(C-9′)，127.8(C-1′)，127.8(C-6)，128.7(C-3)，129.0(C-1)，129.7(C-5)，130.1(C-6′)，130.4(C-2)，132.11(C-5′)，136.4(C-8)，137.7(C-8′)，151.8(C-2′)，157.0(C-4). 參考文獻［6］，未知化合物為 4-O-methylhonokiol。

2.3.2 制備色譜所得化合物的定性

對照品定性，制備色譜所得的化合物為和厚樸酚與厚樸酚，產物經高效液相色譜檢測，采用峰面積歸一化法，和厚樸酚的純度為99.04%，厚樸酚的純度為98.80%。外標法定量，測得的產品質量分數(shù)分別為:和厚樸酚98.45%(圖3A);厚樸酚98.01%(圖3B)。測得所制備的和厚樸酚熔點為87～88℃，厚樸酚熔點為103～104℃。

圖3A 和厚樸酚的純度色譜圖

圖3B 厚樸酚的純度色譜圖

2.3.3 結構鑒定

和厚樸酚:1H NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm:3.33(2H，d，aryl-CH2-)，3.44(2H，d，aryl-CH2-)，5.04-5.22(4H，m，2 × -C=CH2)，5.36(2H，brs，2 ×-OH)，5.92-6.08(2H，m，2× -CH=C)，6.88-7.25(6H，m，ArH).13C NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm:35.1(C-7)，39.4(C-7′)，115.5(C-3)，115.6(C-9′)，116.5(C-5′)，116.8(C-9)，126.4(C-1′)，127.7(C-1)，128.5(C-6′)，128.8(C-4)，129.6(C-3′)，130.2(C-2′)，131.1(C-6)，132.2(C-5)，136.0(C-8′)，137.8(C-8)，150.7(C-2)，153.90(C-4′).與文獻［6］一致。

厚樸酚:1H NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm:3.37(2H，d，aryl-CH2-)，3.39(2H，d，aryl-CH2-)，5.08-5.13(4H，m，2× -C=CH2)，5.93-6.09(2H，m，2× -CH=C)，6.92(2H，br s，2× -OH)，6.94-7.26(6H，m，ArH).13C NMR(400MHz，CDCl3)δ ppm:39.3(C-7，7′)，115.8(C-9，9′)，116.8(C-3，3′)，124.2(C-1，1′)，129.8(C-4，4′)，131.3(C-6，6′)，133.3(C-5，5′)，137.6(C-8，8′)，150.8(C-2，2′).與文獻［6］一致。

3 結論

隨著和厚樸酚與厚樸酚藥理作用研究的不斷深入，此類化合物及其對照品在實驗室的需求量也日益增加。本試驗采用硅膠柱層析與制備型高效液相色譜法分離得到4-O-methylhonokiol、和厚樸酚、厚樸酚，制備色譜法分離和厚樸酚與厚樸酚不僅能夠得到高純度的化合物單體，而且產率高，操作方便，便于收集，純度均大于98%，可作為對照品使用。該色譜分離方法為在天然產物中分離高純度的化合物單體提供了參考。

致謝 感謝西安交大保賽技術總監(jiān)常建華教授以及華陽生物科技有限公司在工作中的幫助與指導。

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