田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選黃芪皂苷的提取工藝

趙強(qiáng)強(qiáng)， 韓 麗*， 謝興亮， 吳品江， 熊永愛(ài)， 楊 明，3*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137;2.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都610083;3.江西中醫(yī)學(xué)院，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.vat.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。黃芪味甘性溫，歸肺、脾經(jīng)。具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效［1］。黃芪含皂苷、黃酮、多糖及氨基酸等多種化學(xué)成分，其中皂苷為黃芪的主要活性成分，并以黃芪甲苷為主［2-3］。黃芪甲苷也是目前黃芪藥材以及制劑質(zhì)量控制的常用指標(biāo)性成分［4］。本實(shí)驗(yàn)采用田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以黃芪甲苷提取量為本研究的控制指標(biāo)，考察提取各因素對(duì)提取效率的影響，優(yōu)化黃芪的提取工藝條件，為工業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD100)(美國(guó)softa公司生產(chǎn))，空氣壓縮機(jī)(天津市琛航科技儀器有限公司);LC-10Atvp泵;CTO-10Asvp柱溫箱;N2000色譜工作站;StartoriousBP211D電子天平;SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781-200613，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。試劑:乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。水為重蒸水。本實(shí)驗(yàn)所用黃芪購(gòu)自四川利民中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室裴瑾副教授鑒定，為膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，按《中華人民共和國(guó)藥典》(2005年版)標(biāo)準(zhǔn)鑒定，使用藥材符合黃芪藥材質(zhì)量規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Welc C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(40∶60);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;ELSD檢測(cè)器條件:漂移管溫度為80℃，載氣(空氣)流量為50psi。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品5.10 mg，加甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻即得。取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 8、10、12、16、20、22 μL，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.419 8x+5.347 7，r=0.999 3黃芪甲苷在4.08～11.22 μg范圍內(nèi)呈良好線性。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄黃芪甲苷峰面積，結(jié)果 RSD為1.26%。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一份供試品溶液于室溫下放置，分別于第 0、2、4、6、8 h 各進(jìn)樣 10 μL，按上述色譜條件檢測(cè)，記錄黃芪甲苷峰面積值，其RSD為2.18%，表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品溶液5份，按上述供試品溶液制備方法制備，按照上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄黃芪甲苷峰面積值，RSD為2.08%。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品溶液(0.113 3 mg/mL)6份，分別精密加入濃度為1.03 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液1.3 mL，按上述供試品溶液制備方法制備，按照上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率為101.62%，RSD為1.88%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.1.7 樣品測(cè)定 將黃芪飲片在50℃烘干，精密稱取各約100 g的藥材9份，按表2中的條件進(jìn)行加熱回流提取。分別取適量提取液水浴揮干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇萃取液，用氨試液萃取2次，每次40 mL，棄去，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，用外標(biāo)法計(jì)算，色譜圖見(jiàn)圖1、2。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.2 提取工藝因素水平的確定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇提取，影響乙醇提取的主要因素有乙醇濃度及用量、提取時(shí)間及次數(shù)，選用L9(3)4正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以黃芪甲苷的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行最佳提取工藝的篩選。正交設(shè)計(jì)表表頭設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)因素水平

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 稱取黃芪飲片100 g 9份，按表2中條件進(jìn)行加熱回流提取。分別測(cè)定黃芪甲苷的提取量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 田口設(shè)計(jì) Taguchi方法根據(jù)對(duì)試驗(yàn)中質(zhì)量特性值要求的數(shù)值范圍不同，分為望目值、望大值和望小值質(zhì)量特性，其中望大值質(zhì)量特性是希望質(zhì)量特性值越大越好，波動(dòng)的程度越小越好。而在試驗(yàn)中，影響質(zhì)量特性波動(dòng)的原因?yàn)橐蛩?，主要分為可控因素和不可控因素?？煽匾蛩刂饕悄軌蛟谠囼?yàn)中人為加以控制的因素，如乙醇濃度及用量、提取時(shí)間及次數(shù)等;不可控因素主要是在試驗(yàn)中事先設(shè)定或較難控制的因素，如標(biāo)示因素、誤差因素等。本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注可控影響因素對(duì)黃芪甲苷提取量的影響。

Taguchi方法能夠充分利用系統(tǒng)中存在的非線性效應(yīng)，通過(guò)選取適當(dāng)?shù)恼辉O(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，然后通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行信噪比分析和方差分析確定各因素的最優(yōu)條件以及影響顯著性程度。本實(shí)驗(yàn)選用L9(3)4正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，在表3中，S/N為信噪比值，信噪比計(jì)算公式如下:

公式中，yi為黃芪甲苷提取量，yexp為預(yù)測(cè)黃芪甲苷提取量，本實(shí)驗(yàn)取望大值，即S/N數(shù)值越大越好。

表3 田口實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算

由于Taguchi方法中，S/N值最大的水平為最優(yōu)水平，因此通過(guò)算術(shù)平均方法求出各個(gè)因素在不同水平上的平均S/N值，并以圖的形式給出了各因素隨不同水平的變化趨勢(shì)(見(jiàn)圖3)。由圖3可知，A因素(乙醇濃度)的3號(hào)水平，B因素(乙醇用量)的3號(hào)水平，C因素(提取時(shí)間)的3號(hào)水平，D因素(提取次數(shù))的3號(hào)水平為各因素的最佳水平。

圖3 各因素在不同水平的S/N變化趨勢(shì)圖

通過(guò)S/N值方差分析考察了各因素對(duì)黃芪甲苷提取量影響的顯著性，方法分析結(jié)果見(jiàn)表4，F(xiàn)值是各因素影響顯著性的重要指標(biāo)，F(xiàn)值越大，說(shuō)明該因素影響越顯著，此外，純平方和在總平方和中所占的比率稱為貢獻(xiàn)率，也可用來(lái)估計(jì)各因素的影響顯著性程度。由表4可見(jiàn)，因素D提取次數(shù)影響最顯著，因素A乙醇濃度、B乙醇用量、和C提取時(shí)間影響較小，即黃芪甲苷的提取量受提取次數(shù)影響遠(yuǎn)大于其他因素。

表4 方差分析

通過(guò)平均S/N值，結(jié)合方差分析結(jié)果，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本及安全性等問(wèn)題，故選A、B、C三因素的1號(hào)水平，D因素的3號(hào)水平。采用design expert7.1軟件A1B1C1D3預(yù)測(cè)了各因素在上述最優(yōu)水平條件下信噪比值S/N為-1.794 4，將此值帶入S/N計(jì)算公式，可以得出黃芪甲苷提取量的最佳預(yù)測(cè)值為0.81 mg/g。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于所選方案是正交表中沒(méi)有的方案，故尚需做實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。取與上述正交實(shí)驗(yàn)同批次的黃芪飲片250 g，共3份，按方案A1B1C1D3進(jìn)行提取，其余操作同前，結(jié)果見(jiàn)表5，與預(yù)測(cè)結(jié)果比較，差別不大，結(jié)果較為滿意。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用正交表挑選試驗(yàn)條件、安排試驗(yàn)的方法。其設(shè)計(jì)過(guò)程分3個(gè)階段，即:系統(tǒng)設(shè)計(jì)、參數(shù)設(shè)計(jì)和容差設(shè)計(jì)。其中重點(diǎn)是參數(shù)設(shè)計(jì)，而參數(shù)設(shè)計(jì)的重點(diǎn)是穩(wěn)定性設(shè)計(jì)。常采用信噪比(S/N)作為衡量穩(wěn)定性好壞的指標(biāo)。

該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的優(yōu)點(diǎn)是成功地運(yùn)用以信噪比作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，以尋求最優(yōu)的穩(wěn)定性好的參數(shù)組合［5］，并能實(shí)驗(yàn)最佳組合進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3.2 由于黃芪甲苷僅在200 nm左右有微弱的末端吸收，采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)干擾大，靈敏度低，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)對(duì)無(wú)紫外吸收的化合物具有較高的檢測(cè)靈敏度，因此選用HPLC-ELSD對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:212.

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［3］Xiao H B，Krucker M，Putzbach K，et al.Capillary liquid chromatography-microcoil H-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy and liquid chromatography-ion trap mass spectrometry for on-line structure elucidation of isoflavones in Radix astragali［J］.J Chromatogr，2002(1):135-143.

［4］夏廣萍，劉 鵬，韓英梅.不同處理方法和不同產(chǎn)地黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測(cè)定［J］.中藥材，2008，31(3):386.

［5］施月芹，練富林，胡育筑.田口方法及其在藥學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2008，32(8):363.