芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型小氣道重塑的影響

李金田， 梁 晶， 田永衍， 劉永琦， 李 娟， 任紅艷， 張 騫， 張 毅

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，該病氣流受限不完全可逆并呈進(jìn)行性發(fā)展，同時(shí)因有害顆粒和氣體的吸入而致肺部炎癥［1］。本病屬中醫(yī)學(xué)咳嗽、喘證、哮證、肺脹等范疇［2，3］。COPD 由于其患病人數(shù)多，死亡率高，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，受到世界各國(guó)的重視。目前的西醫(yī)治療雖能有效緩解癥狀和并發(fā)癥，但仍沒(méi)有藥物能夠有效控制COPD肺功能進(jìn)行性下降。中醫(yī)中藥治療COPD則有著十分廣闊的前景，本研究通過(guò)對(duì)COPD模型大鼠肺組織病理切片MASSON染色的觀察，采用放射免疫分析法對(duì)其支氣管肺泡灌洗液(BALF)以及血清中層黏連蛋白(LN)和透明質(zhì)酸(HA)的測(cè)定，以探討芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒對(duì)COPD小氣道重塑的影響。

材料與方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)Wistar大鼠60只，♀♂各半，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK(甘)2004-0006-0000005)。

1.2 飼養(yǎng)環(huán)境

動(dòng)物室為SPF級(jí)，環(huán)境溫度(23±3)℃，相對(duì)濕度30% ～40%，日光燈采光。清潔級(jí)飼料喂養(yǎng)，經(jīng)高壓消毒處理，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 受試藥物

按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量。

治療藥物:芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒(由黃芪、水蛭、黨參、丹參、麥冬、五味子、枳實(shí)等按一定比例組成，由甘肅中醫(yī)學(xué)院藥物制劑教研室提供);對(duì)照藥物:固本咳喘片(臺(tái)州南峰藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):070504)。

1.4 主要試劑

蘭州牌香煙(焦油量:12 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量13 mg):甘肅·蘭州卷煙廠;脂多糖(LPS)，10 mg/支，Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào):L-2880;烏拉坦:中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;LN放免試劑盒:購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):20080825;HA放免試劑盒:購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):20080825。

1.5 主要儀器

AE200電子分析天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司);GC-9111型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);KDC-2044低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);恒溫水浴箱:上海醫(yī)療器械七廠;光學(xué)顯微鏡:德國(guó)。型號(hào):CX31-32L02;石蠟切片機(jī):德國(guó)。型號(hào):RM2135;石蠟包埋機(jī):日本。型號(hào):TEC-VEM-J2;石蠟脫水機(jī):日本。型號(hào):VIP-5JR-J2。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為:空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組、芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒小劑量組、芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒中劑量組、芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒大劑量組。每組10只，雌雄各半。

2.2 慢性阻塞性肺疾病模型制備

采用宋一平等［4］的方法并加以改良建立慢性阻塞性肺疾病模型大鼠。①在正常的室溫環(huán)境中，第1、14天將大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴入LPS:大鼠逐一稱重，按5 mL/kg體重的比例，腹腔注射濃度為20%的烏拉坦溶液，大鼠麻醉后，將其固定于解剖臺(tái)上，且采用頭低位暴露聲門，行氣管插管后，快速注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1 mg/mL的LPS 0.2 mL，將大鼠直立，左右旋轉(zhuǎn)，使LPS在兩側(cè)肺內(nèi)均勻分布，后置于安靜處，待其自然清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。② 第2～28天(滴LPS當(dāng)天不煙熏)給予大鼠每天一次香煙煙熏，每只大鼠一支煙，持續(xù)時(shí)間大約1/2 h。被動(dòng)吸煙方法:將大鼠放入自制的容積為48 L的玻璃染毒箱(箱底兩側(cè)各有直徑3 cm的進(jìn)煙孔，箱蓋中央有一直徑3 cm的通氣孔)內(nèi)，香煙點(diǎn)燃后，進(jìn)行大鼠被動(dòng)吸煙染毒。為減少香煙燃燒所產(chǎn)的水蒸氣對(duì)大鼠的影響，在箱底放置適量硅膠干燥劑。

2.3 藥物治療

從第15天起，空白對(duì)照組、模型組給予中劑量顆粒輔料溶液3 mL灌胃;陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予固本咳喘片溶液3 mL［相當(dāng)于成藥0.324 g/(kg·d)］灌胃治療;芪蛭大劑量組［相當(dāng)于生藥2.16 g/(kg·d)］;芪蛭中劑量組［相當(dāng)于生藥1.08 g/(kg·d)］;芪蛭小劑量組［相當(dāng)于生藥0.54 g/(kg·d)］均給予芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒溶液3 mL灌胃治療。每日1次，連續(xù)灌胃28 d，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)42 d。實(shí)驗(yàn)藥物的劑量換算:在對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃時(shí)，治療藥物和對(duì)照藥物用量均按體表面積比率換算法(D2=D1×0.018×5)配制藥液，臨床等效劑量為實(shí)驗(yàn)的中劑量。

2.4 樣本采集及制作

濃度為20%烏拉坦溶液，按5 mL/kg體重腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，經(jīng)股動(dòng)脈采血，離心取血清約為1 mL，處死大鼠，分離肺臟，夾閉右肺，用3 mL生理鹽水灌洗左側(cè)肺臟，反復(fù)2次，回收量約為4 mL，離心，取上清液1 mL，同血清一起置于-20℃冰箱待測(cè)。用放免法檢測(cè)BALF以及血清中LN和HA水平(按試劑盒說(shuō)明書操作)。然后松開右肺，夾閉左側(cè)肺臟，摘取右肺下葉，用4%多聚甲醛溶液固定一周，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片，MASSON染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 病理組織學(xué)所見

肺組織切片經(jīng)MASSON染色后顯示(鏡下觀察):膠原纖維呈現(xiàn)淡藍(lán)色，肌肉、胞漿呈現(xiàn)紅色，胞核呈現(xiàn)藍(lán)黑色?？瞻讓?duì)照組:可見中、末支氣管壁有較薄的膠原層，肺泡區(qū)有少量的膠原。模型組:支氣管壁、肺間質(zhì)、肺泡隔呈現(xiàn)膠原纖維明顯增多，支氣管周圍膠原增生明顯，并向肺間質(zhì)延伸并且沉積。芪蛭小劑量組:中、末支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維沉積，但與模型組相比為少，兩組差異不明顯。芪蛭中劑量組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維沉積，但與模型組相比明顯減少，兩組差異較為顯著。芪蛭大劑量組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維與模型組相比為最少。陽(yáng)性對(duì)照組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維較模型組明顯減少。

2 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積的比較(見表1)

表1 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積(±s)

表1 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01;與 COPD模型組比較，●●P＜0.01;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，＆P＜0.05。

組別 例數(shù)/個(gè) 膠原平均面積/×104μm2空白對(duì)照組10 3.58±1.58模型組 8 21.14±6.33▲▲芪蛭小劑量組 8 10.41±3.90●●＆芪蛭中劑量組 9 5.11±2.65●●芪蛭大劑量組 9 5.57±3.50●●陽(yáng)性對(duì)照組 9 6.00±3.28●●

結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，模型組肺膠原平均面積顯著升高，P＜0.01。與COPD模型組相比，芪蛭小、中、大劑量、陽(yáng)性對(duì)照組肺膠原平均面積顯著下降，P＜0.01。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，芪蛭小劑量組肺膠原平均面積明顯下降，P＜0.05。

3 各組大鼠BALF中HA、LN含量的比較(見表2)

表2 各組大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)

表2 各組大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01;與COPD模型組比較，●P＜0.05，●●P ＜0.01;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。

組別 例數(shù)/個(gè) LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白對(duì)照組10 20.54±4.43 26.28±6.61模型組 8 33.86±5.90▲▲ 86.37±15.29▲▲芪蛭小劑量組 8 28.73±7.10 75.50±11.57芪蛭中劑量組 9 24.52±7.53●● 47.60±11.09●●＆＆芪蛭大劑量組 9 20.84±6.20●●＆ 38.58±4.52●●＆＆陽(yáng)性對(duì)照組 9 27.19±4.35● 69.48±16.33●●

結(jié)果顯示，模型組BALF中LN、HA含量與空白對(duì)照組相比顯著升高，P＜0.01。芪蛭中、大劑量組BALF中LN、HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。陽(yáng)性對(duì)照組BALF中LN含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05。陽(yáng)性對(duì)照組BALF中HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。芪蛭大劑量組BALF中LN含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比明顯下降，P＜0.05。芪蛭中、大劑量組BALF中HA含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著下降，P＜0.01。

4 各組大鼠血清中HA、LN含量的比較(見表3)

表3 各組大鼠血清中LN、HA的含量(±s)

表3 各組大鼠血清中LN、HA的含量(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01;與COPD模型組比較，●P＜0.05，●●P ＜0.01;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。

組別 例數(shù) LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白對(duì)照組10 25.76±3.87 293.48±60.89模型組 8 41.06±8.79▲▲ 483.05±64.24▲▲芪蛭小劑量組 8 34.08±5.63● 415.47±93.66＆＆芪蛭中劑量組 9 31.39±5.71●● 389.57±89.21●＆芪蛭大劑量組 9 28.36±6.44●● 320.38±48.29●●陽(yáng)性對(duì)照組 9 34.04±7.71● 312.25±68.18●●

結(jié)果顯示，模型組血清中LN、HA含量與空白對(duì)照組相比顯著升高，P＜0.01。芪蛭小劑量組血清中LN含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05。芪蛭中劑量組血清中LN含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01，HA含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05。芪蛭大劑量組血清中LN、HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。陽(yáng)性對(duì)照組血清中LN含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05，HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。芪蛭小劑量組血清中HA含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著升高，P＜0.01。芪蛭中劑量組血清中HA含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比明顯升高，P ＜0.05。

討 論

在COPD發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，導(dǎo)致肺組織內(nèi)部小氣道重塑的原因是多方面的，其中肺內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)主要成分膠原蛋白、蛋白多糖及黏連糖蛋白是支氣管肺組織的炎癥、損傷、修復(fù)、重塑的重要原因，是COPD不斷發(fā)展的病理基礎(chǔ)。

膠原蛋白是ECM的主要成分，肺臟的膠原成分是維持肺臟結(jié)構(gòu)的完整性、間隔性和具有容積功能的基礎(chǔ)。膠原分布于肺結(jié)締組織網(wǎng)的各個(gè)部位。I型和Ⅲ型膠原是肺間質(zhì)的主要纖維成分，因此膠原在肺臟沉積與降解速度之間的平衡狀態(tài)，對(duì)于維持肺臟的正常結(jié)構(gòu)與功能具有十分關(guān)鍵性的作用。通過(guò)對(duì)病理觀察，可以明顯看到芪蛭大劑量組膠原減少最為顯著，中劑量組膠原平均面積為最少。

LN是存在于ECM中的一種糖蛋白，且與膠原一同構(gòu)成基底膜骨架，對(duì)ECM的代謝起著極為重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，LN具有刺激細(xì)胞遷移、黏附、分化和生長(zhǎng)等豐富的生物學(xué)活性，在肺組織纖維化病變進(jìn)展中具有非常重要的作用［5］;LN的增多可以使炎性細(xì)胞數(shù)量增多，同時(shí)積聚于基底膜，導(dǎo)致肺組織纖維化［6］;LN的增多還提示上皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷、破壞，不斷有新的細(xì)胞生長(zhǎng)，增生和修復(fù)，導(dǎo)致上皮增厚［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芪蛭大、中劑量組大鼠BALF以及血清中LN含量同模型組相比顯著降低，其中在BALF中芪蛭大劑量組與陽(yáng)性藥物組相比有明顯差異，且作用要優(yōu)于中劑量組和陽(yáng)性組。說(shuō)明大劑量芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒在對(duì)COPD大鼠肺組織LN的代謝、肺臟纖維化和小氣道的重塑方面，發(fā)揮著重要的作用。

HA是ECM中糖胺聚糖的主要成分。已經(jīng)有研究指出 HA與很多肺臟疾患的發(fā)生有關(guān)［5］，是COPD敏感的炎癥標(biāo)志物［8］，還參與膠原纖維的合成作用，能使靜止的纖維細(xì)胞活化，形成具有合成和分泌膠原蛋白功能的成纖維細(xì)胞。而肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖以及通過(guò)釋放介質(zhì)使肺內(nèi)ECM產(chǎn)生增多，因此，HA在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芪蛭中劑量組、大劑量組、陽(yáng)性組大鼠BALF中HA含量比模型組顯著降低;芪蛭中、大劑量組同陽(yáng)性藥物組相比有顯著性差異;其中大劑量組的作用要優(yōu)于中劑量組。這一結(jié)果說(shuō)明大劑量芪蛭皺肺無(wú)糖顆?？擅黠@干預(yù)COPD大鼠肺臟HA的代謝，進(jìn)而影響COPD肺組織纖維化和小氣道的重塑。

COPD的病因不外乎外感與內(nèi)傷。肺系病易虛易實(shí)，結(jié)合本病的特點(diǎn)，可以概括為肺脾腎虛、痰瘀阻肺。肺、脾、腎三臟之虛是COPD反復(fù)發(fā)作的重要內(nèi)因，血瘀貫穿慢性阻塞性肺疾病始終，是其重要的病理改變。芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒，方中黃芪為補(bǔ)肺氣要藥，補(bǔ)氣以助血行;水蛭破血逐瘀，消散肺中瘀血，共為君藥;黨參健脾益肺，既助黃芪補(bǔ)肺氣，又擅補(bǔ)脾氣而培土生金;丹參既補(bǔ)血又活血，使補(bǔ)而不滯，活而不傷，均為臣藥。五味子斂肺滋腎，麥冬以養(yǎng)陰潤(rùn)肺，既收耗散之肺氣，又潤(rùn)虛損之肺陰;枳實(shí)開肺脾之氣而消痞脹，化痰飲，俱為佐藥。諸藥合用，標(biāo)本兼治，虛實(shí)共調(diào)，有益氣培元，化痰活血，癟皺肺脹之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒可以緩解肺內(nèi)細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管管腔及周圍膠原纖維的浸潤(rùn)和分泌物阻塞，恢復(fù)纖毛黏連、倒伏、脫落，且芪蛭大劑量組大鼠BALF以及血清中HA以及LN含量較模型組明顯降低，芪蛭中劑量組膠原平均面積最小為各組中最小。結(jié)合其病理特點(diǎn)，說(shuō)明芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒通過(guò)補(bǔ)氣活血通絡(luò)的方法，在COPD進(jìn)行性加重過(guò)程中，對(duì)小氣道重塑具有重要的干預(yù)作用。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25(8):453.

［2］王會(huì)仍，王效亞，沈崇芳，等.肺氣管與肺功能變化規(guī)律的初步探討［J］.中醫(yī)雜志，1983，(2):6.

［3］蘇梅者，方文賢，金辰羲，等.慢性咳喘病中醫(yī)辨證與肺功能關(guān)系的研究［J］.中醫(yī)雜志，1990，31(3):174.

［4］宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22(2):99-102.

［5］高 鋒，孔憲濤，王笑利，等.細(xì)胞外間質(zhì)成分與肝病關(guān)系的研究［J］.中華內(nèi)科雜志，1994，33(2):109.

［6］許 滸，熊 密，黃慶華.細(xì)菌感染導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的探討［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22(12):739-742.

［7］黃翠萍，楊和平，張珍祥.參麥注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷防護(hù)機(jī)制探討［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28(1):67-68.

［8］郭庭杰.COPD患者肺內(nèi)的透明質(zhì)酸水平增高與肺功能和局部炎癥的相關(guān)性［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2006，33(2):92.