桃兒七HPLC指紋圖譜研究

熊文勇， 魏朔南， 岳 明

(西北大學(xué)西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，陜西西安710069)

桃兒七(Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying)是小檗科鬼臼亞科桃兒七屬多年生草本植物，分布于云南、西藏、四川、湖北、陜西、青海、甘肅、寧夏等省區(qū)［1］，主要生長在海拔2 700～4 500 m的喜馬拉雅山及附近地區(qū)，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、心胃痛、風(fēng)寒咳嗽、月經(jīng)不調(diào)、解鐵棒錘中毒等。其干燥果實為小葉蓮，為藏族人民常用的中草藥，已被《中華人民共和國藥典》收載。其根和根莖中主要含有木脂素類、黃酮類、皂苷、多糖及鞣質(zhì)等化學(xué)成分［2］。

近年來，有關(guān)桃兒七藥材的研究主要集中在建立色譜方法定量分析鬼臼毒素含量及對桃兒七成分的研究上，而對于桃兒七指紋圖譜方面的研究文獻(xiàn)資料報道較少，粟曉黎［3］等主要是以鬼臼中的毒性成分為分析對象，根據(jù)其4-苯基四氫奈駢丁內(nèi)酯類木脂素化合物結(jié)構(gòu)中存在的共軛系統(tǒng)具有特征紫外吸收的特性，優(yōu)化適宜的色譜方法，建立桃兒七指紋圖譜并與威靈仙、龍膽HPLC圖譜比較。同時粟曉黎［3］還指出毒性中藥鬼臼的質(zhì)量控制，除要建立主要毒性成分鬼臼毒素的含量測定方法，制定含量限度外，建立毒性成分群的指紋圖譜分析方法，更有利于全面掌握藥材質(zhì)量及毒性強(qiáng)弱，亦便于分析比較不同來源“鬼臼”藥材毒成分群的異同［3］。

基于以上分析，鑒于桃兒七在生產(chǎn)和醫(yī)藥中的應(yīng)用越加廣泛，本實驗室決定對不同生長地桃兒七進(jìn)行系統(tǒng)的指紋圖譜研究。然而由于其化學(xué)成分十分復(fù)雜［4］(尚明英，2000)，我們發(fā)現(xiàn)用已有的色譜方法均不能使鬼臼毒素類木脂素得到很好的分離。因此，本實驗在參考已有文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上［5］，采用反向高效液相色譜法，優(yōu)化色譜工藝，建立了不同生長地桃兒七的HPLC指紋圖譜，并對其進(jìn)行相似度比較。本實驗方法克服了文獻(xiàn)報道中分離度低，峰形不好等缺點(diǎn)，同時選定鬼臼毒素為內(nèi)參比，測定了不同生長地桃兒七中19個共有峰的相對含量。該法操作簡單，準(zhǔn)確度、靈敏度高，精密度好，易于采用，對于桃兒七種質(zhì)資源的評價，快速鑒別桃兒七藥材鬼臼毒素含量，提高中藥桃兒七質(zhì)量，保護(hù)瀕危物種具有現(xiàn)實意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp檢測器，Class-VP工作站，紫外分光光度計(PERKINELMER、編號:20032428)，DL-180超聲波清洗器(浙江海天電子儀器廠)，MA200電子天平，色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、系列號:8132298。

1.2 試劑

乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(分析純)，均購于天津化學(xué)試劑廠，水為超純凈水，其它試劑均為分析純。

1.3 樣品及對照品

實驗材料桃兒七樣品分別于9月份果熟期采自寧夏、甘肅、四川、云南4省6個地區(qū)(甘肅舟曲縣插崗、寧夏六盤山、云南中甸納帕海、四川馬爾康刷經(jīng)寺、四川康定榆林鄉(xiāng)、甘肅興隆山)，涵蓋了除西藏和陜西(2007和2008年均未能采到野生桃兒七)的國內(nèi)所有主要分布區(qū)。鬼臼毒素標(biāo)品(購自陜西藥品生物制品檢定所，批號:111645-200301)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱 Diamonsil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:0.5 mL/min;檢測波長:290 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動相:乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)，采用梯度程序洗脫(見表1)，色譜采集時間為120 min。

表1 梯度程序Tab.1 Gradient procedures

2.2 標(biāo)品溶液的制備

精密稱取鬼臼毒素標(biāo)品0.001 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即為標(biāo)品溶液，進(jìn)樣前用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.3 樣品溶液的制備

取樣品桃兒七將其粉碎，過40目篩，精密稱取約0.1 g粉末，超聲波振蕩提取3次，每次30 min，加甲醇3 mL，過濾，合并濾液，定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，備用。

2.4 空白試驗

取“樣品溶液的制備”項下所用甲醇為空白溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析(結(jié)果見圖1)。結(jié)果表明:保留時間位于0～10 min為空白溶劑峰。

圖1 空白HPLC色譜圖Fig.1 Chromatography of blank

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取鬼臼毒素標(biāo)品溶液 2、4、6、8、10、12、14 μL，進(jìn)樣測定，記錄其高效液相色譜圖譜(圖2)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸直線方程為Y=52 503X+38 464，r2=0.999 4。結(jié)果表明鬼臼毒素在 0.2 ～1.4 μg間具有良好的線性關(guān)系。

圖2 鬼臼毒素對照品HPLC色譜圖Fig.2 Chromatography of podophyllotoxin

2.6 樣品分析

將桃兒七制成的供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各樣品的HPLC色譜圖，同時標(biāo)定共有峰。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，確定鬼臼毒素的位置(見圖3)。

圖3 桃兒七樣品HPLC色圖譜Fig.3 Chromatography of sample

3 實驗結(jié)果

3.1 色譜條件的確定

3.1.1 流動相的選擇

實驗過程中研究了①甲醇-水;②乙腈-水;③乙腈-甲酸水(0.06%);④乙腈-甲酸水(0.04%)等多種流動相系統(tǒng)，并進(jìn)行梯度洗脫程序設(shè)計，結(jié)果表明在④號條件下所得色譜圖峰數(shù)較多、峰形較好并達(dá)到基線分離，故選?、芴栂到y(tǒng)為實驗流動相，最終梯度洗脫程序見表1。

3.1.2 檢測波長的選擇

將桃兒七樣品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描(見圖4)，分別在210、245、265、290 nm出現(xiàn)4個吸收峰，以210 nm 處吸收峰最大。本實驗分別以這4個波長為檢測波長進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在210 nm處背景吸收大，色譜圖基線不平穩(wěn)，245、265及290 nm處色譜圖吸光值較接近，290 nm處色譜圖不僅表現(xiàn)有較強(qiáng)吸收而且各色譜峰均達(dá)到基線分離，背景干擾小，出峰數(shù)較其它波長條件下多，峰形較好，因而選擇290 nm為指定檢測波長。

圖4 桃兒七紫外吸收曲線Fig.4 Ultraviolet absorption cure of Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying

3.2 方法學(xué)考察

為考察分析方法的可靠性，本實驗以甘肅舟曲縣插崗所采桃兒七樣品為例，對其穩(wěn)定性、精密度、實驗方法重復(fù)性及回收率進(jìn)行考察。

3.2.1 穩(wěn)定性實驗

取樣品桃兒七粉末(樣品號:S1)，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成供試溶液，分別在0、3、6、9、12、15、24、48 h等8個時間點(diǎn)進(jìn)樣考察，每次10 μL，記錄HPLC色譜圖，考察色譜峰相似度一致性。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004版A版進(jìn)行相似度的評價，結(jié)果顯示相似度的平均值為0.998，RSD=0.05%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.2 精密度實驗

取同一供試品溶液(樣品號:S1)，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄HPLC色譜圖，考察色譜峰相似度一致性。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004版A版進(jìn)行相似度的評價，結(jié)果顯示相似度的平均值為 0.995，RSD =0.15%。表明本法精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性實驗

取同一桃兒七樣品5份(樣品號:S1)，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成供試溶液，每份進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖，考察色譜峰相似度一致性。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004版A版進(jìn)行相似度的評價，結(jié)果顯示相似度的平均值為0.997，RSD=0.08%。表明本法重復(fù)性良好。

3.2.4 回收率實驗

精密稱取3份同一已知鬼臼毒素量的樣品0.100 0 g(樣品號:S1)，按照“樣品溶液的制備”項下的方法制成供試溶液，準(zhǔn)確加入鬼臼毒素對照品0.596 5 mg，制備供試品溶液3份，每份進(jìn)樣 10 μL，重復(fù)3次，測定鬼臼毒素的峰面積，計算平均回收率為97.28%，RSD=0.37%(n=9)。

3.3 指紋圖譜的建立與評價

3.3.1 共有指紋峰的標(biāo)定

根據(jù)“樣品分析”項下所得桃兒七HPLC液相色譜圖，選擇穩(wěn)定性較好、吸收性較強(qiáng)、特征較明顯的色譜峰為共有峰，最終共標(biāo)定共有指紋峰19個，與16號峰(鬼臼毒素)相比，其他18個共有指紋峰相對保留時間如表2所示，共有指紋峰的相對峰面積如表3。表2和表3顯示出各共有峰的相對保留時間差異很小，而相對峰面積則差異較大。

表2 共有峰的相對保留時間(n=3)Tab.2 Relative retention time of common peaks(n=3)

3.3.2 指紋圖譜的建立

將6個桃兒七樣品的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版相似度軟件，以甘肅舟曲縣插崗產(chǎn)樣品指紋圖譜為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)定為0.10，建立多點(diǎn)匹配指紋圖譜(見圖5)。

3.3.3 指紋圖譜的評價

使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版相似度軟件，通過標(biāo)定不同數(shù)目的共有峰5個(峰號:9、10、11、13、16)、10 個(峰號:4、5、6、7、8、9、10、11、13、16)、15 個(峰號:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、19)、19 個(峰號:1～19)進(jìn)行匹配，以中位數(shù)法生成對照圖譜可以得到多組相似度計算結(jié)果(見表4)，R為生成對照譜。由表4可見，6個不同生長地桃兒七樣品的HPLC指紋圖譜相似度最高為0.988(S5的15、19)，最低為0.864(S3的5)。

表3 共有峰的相對峰面積(n=3)Tab.3 Relative area of common peaks(n=3)

圖5 樣品指紋圖譜Fig.5 Fingerprints of sample

表4 相似度分析結(jié)果Tab.4 Result of similarity

3.4 共有峰含量標(biāo)定

結(jié)合文獻(xiàn)資料，本實驗選取鬼臼毒素作為內(nèi)參比物，根據(jù)共有峰的相對峰面積，標(biāo)定6個生長地19個共有峰的相對含量(見表5)。由表5可見6個不同生長地桃兒七19個組分的含量存在明顯不同，以鬼臼毒素為例，含量最高達(dá)9.834(S2)，而最低只有4.512(S3)，相差近一半。

表5 共有峰的相對含量(n=3，‰)Tab.5 The relative content of common peaks(n=3，‰)

4 討論

4.1 中藥指紋圖譜是指某種或某產(chǎn)地中藥材或中成藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥材或中成藥特性共有峰的圖譜。而要建立合適的中藥指紋圖譜，并不要求對每個組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)都清楚，也不要求對呈現(xiàn)在指紋圖譜中的每個共有成分都清楚的定量，只需盡量將主要特征峰展現(xiàn)出來，利用相關(guān)色譜軟件和色譜分析方法對其加以分析。因此，色譜條件優(yōu)化是建立指紋圖譜的關(guān)鍵。本實驗通過提取效率、檢測波長、流動相及其比例、色譜采集時間等實驗的系統(tǒng)研究，所建立的不同生長地桃兒七指紋圖譜研究方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性及回收率實驗的RSD均在0.05%～0.37%之間，表明使用本法進(jìn)行桃兒七指紋圖譜研究具有操作簡單，準(zhǔn)確度、靈敏度高，精密度好，易于采用。

4.2 中藥指紋圖譜是通過對各樣本色譜圖進(jìn)行比較，采用夾角余弦算法對各樣品進(jìn)行整體相似度評價，反應(yīng)其化學(xué)成分的差異，從而實現(xiàn)對中藥材或中成藥的鑒別和質(zhì)量評價。陳毓亨［6］、王京昆［1］等對采收季節(jié)相同但產(chǎn)地不同的桃兒七成分進(jìn)行測定，結(jié)果表明甘肅甘南地區(qū)所產(chǎn)桃兒七中鬼臼毒素的含量明顯高于四川、云南所產(chǎn)的桃兒七［6，7］。粟曉黎［3］等對中藥鬼臼毒性成分HPLC/UV指紋圖譜分析方法研究及與威靈仙、龍膽HPLC圖譜比較，結(jié)果顯示不同來源桃兒七中鬼臼類成分相對含量存在明顯的不同，其中鬼臼毒素含量較高，同時桃兒七與威靈仙、龍膽HPLC圖譜間存在明顯差別。本研究結(jié)果顯示，甘肅所采桃兒七鬼臼毒素含量(6.969，8.582)總體高于四川(5.675，7.533)，含量最高為寧夏(9.834)，最低為云南(4.512)，與文獻(xiàn)結(jié)果基本一致。本實驗采用選擇不同數(shù)量共有峰(5、10、15、19)進(jìn)行相似度評價結(jié)果顯示，采自云南中甸納帕海地區(qū)的桃兒七相似度最低(0.864～0.900)，其余不同產(chǎn)地桃兒七相似度均在0.900以上，表明其化學(xué)成份組成基本一致。相對含量測定結(jié)果顯示，同一省區(qū)內(nèi)桃兒七中不僅鬼臼毒素含量存在差異(甘肅舟曲縣插崗與興隆山，四川馬爾康刷經(jīng)寺與康定榆林鄉(xiāng))，而且6個不同生長地桃兒七各共有峰相對含量之間、共有峰總含量之間均普遍存在差異，推測其原因與生長年限及生長環(huán)境有關(guān)。至于是生長年限還是環(huán)境生態(tài)因子對桃兒七中鬼臼毒素類化學(xué)成分的影響起主要作用則有待進(jìn)一步研究探討。

［1］中國科學(xué)院植物研究所.中國植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1997.

［2］劉海軍，徐 艷，蘇國慶，等.桃兒七的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2004，35(1):98-100.

［3］粟曉黎，林瑞超，王兆基，等.中藥鬼臼毒性成分HPLC/UV指紋圖譜分析方法研究及與威靈仙、龍膽HPLC圖譜比較［J］.中成藥，2000，22(12):819-824.

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［5］王曉玲，楊伯倫，劉謙光，等.鬼臼毒素的提取及其溶劑加合物的表征［J］.中草藥，2003，34(4):330-331.

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［7］王京昆，趙元鴻，李瑞英.薄層色譜-紫外分光光度法測定鬼臼毒素含量的研究［J］.云南化工，1995，2:36-38.