胃癌發(fā)生過(guò)程中DNA修復(fù)蛋白表達(dá)的意義

溫 爽，劉天卿 ，劉飛飛，劉志敏，呂 申

(1.大連市友誼醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116001；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 病理科，山東 濟(jì)寧 272013；3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116027)

胃癌的發(fā)生與其他惡性腫瘤一樣，可能與DNA損傷有關(guān)。機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在多種DNA修復(fù)方式，主要包括錯(cuò)配修復(fù)、損傷直接逆轉(zhuǎn)、堿基切除修復(fù)及同源重組修復(fù)等[1]。

錯(cuò)配修復(fù)(MMR)可以修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中的堿基錯(cuò)配，保證DNA復(fù)制忠實(shí)性[2]。hMSH2是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中的一種非常重要的基因。損傷直接逆轉(zhuǎn)(DR)為最簡(jiǎn)單的修復(fù)方式，是在酶的作用下，直接將損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。MGMT是這種修復(fù)方式中最具代表性的一個(gè)蛋白，主要修復(fù)烷化劑導(dǎo)致的DNA損傷。同源重組修復(fù)(HR)可有效修復(fù)因DNA 代謝、電離輻射和活性氧損傷等原因而產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂，可以維護(hù)基因組的完整性和基因的正常表達(dá)[3]。XRCC2 和XRCC3 是同源重組修復(fù)系統(tǒng)中不可缺少的基因，對(duì)維持染色體的穩(wěn)定性是必須的。任何一種DNA修復(fù)基因及其產(chǎn)物表達(dá)異常，都會(huì)引起細(xì)胞修復(fù)功能缺陷，使基因組不穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤信息累積，以致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析胃癌組織、癌旁黏膜和非癌患者胃黏膜DNA修復(fù)基因蛋白的表達(dá)情況，探討胃癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料

收集大連市友誼醫(yī)院2002～2004年診斷明確的胃鏡活檢標(biāo)本，胃癌標(biāo)本56例(癌組)，癌旁黏膜同時(shí)取材(癌旁組)?；颊吣?0例、女16例；年齡18～89歲，平均61.8歲；非腫瘤(胃炎)患者胃黏膜標(biāo)本30例(正常組)，提供者男10例、女20例；年齡17～75歲，平均51.4歲。

1.2 試劑與方法

鼠抗人hMSH2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Pharmacia 公司；鼠抗人MGMT、XRCC2及XRCC3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。按試劑盒說(shuō)明用常規(guī)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。用已知蛋白陽(yáng)性標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，PBS取代一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

hMSH2、MGMT 、XRCC2 及XRCC3蛋白主要在上皮細(xì)胞細(xì)胞核及部分胞漿表達(dá)。細(xì)胞核或漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。hMSH2蛋白陽(yáng)性率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)與腫瘤細(xì)胞總數(shù)之比)≥20%、MGMT蛋白的≥40%、XRCC2蛋白的≥10%、XRCC3蛋白的≥30%為陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所得結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織、癌旁黏膜及非癌患者胃黏膜hMSH2、MGMT、XRCC2、XRCC3蛋白的表達(dá)

如表1所示，胃癌組織hMSH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76.8%(43/56)，明顯高于癌旁和非癌患者胃黏膜的 33.9%(19/56)和 33.3%(10/30)(P<0.05)，后兩者間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)(圖1)。胃癌組織MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為26.8%(15/56)，與癌旁黏膜的32.1% (18/56)相比差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，但二者均明顯低于非癌患者胃黏膜的73.3%(22/30)(P<0.05)(圖2)。胃癌組織XRCC2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為32.1%(18/56)，明顯高于癌旁和非癌患者胃黏膜的3.6% (2/56)和0%(0/30)(P<0.05)，后兩者間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)(圖3)。胃癌組織XRCC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76.8%(43/56)，明顯高于癌旁和非癌患者胃黏膜的35.7% (20/56)和36.7%(11/30)(P<0.05)，后兩者間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)(圖4)。

2.2 不同分化程度胃癌hMSH2、MGMT、XRCC2、XRCC3蛋白的表達(dá)

粘液癌、低分化及高中分化癌組hMSH2、MGMT、XRCC2及XRCC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 hMSH2與MGMT、XRCC2、XRCC3表達(dá)的關(guān)系

胃癌組織中hMSH2陽(yáng)性組和陰性組MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.333，P<0.05)。癌旁黏膜和非癌患者胃黏膜中hMSH2陽(yáng)性組和陰性組MGMT、XRCC2及XRCC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。胃癌組織、癌旁黏膜及非癌患者胃黏膜中hMSH2陽(yáng)性組和陰性組XRCC2和XRCC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

圖1 胃癌hMSH2蛋白表達(dá) 400×Fig1 hMSH2 protein expression in gastric carcinoma 400×

圖2 胃癌MGMT蛋白表達(dá) 400×Fig 2 MGMT protein expression in gastric carcinoma 400×

圖3 胃癌XRCC2蛋白表達(dá) 400×Fig 3 XRCC2 protein expression in gastric carcinoma 400×

圖4 胃癌XRCC3蛋白表達(dá) 400×Fig 4 XRCC3 protein expression in gastric carcinoma 400×

表1 胃癌組織、癌旁黏膜及非癌患者胃黏膜hMSH2、MGMT、XRCC2、XRCC3蛋白的表達(dá)Tab1 hMSH2、MGMT、XRCC2 and XRCC3 expression in carcinoma，surrounding epithelia and non carcinoma gastric mucosa

1)與癌旁組和正常組相比,P<0.05；2)與癌組和癌旁組相比,P<0.05

表2 不同分化程度胃癌hMSH2，MGMT，XRCC2，XRCC3蛋白的表達(dá)Tab 2 hMSH2、MGMT、XRCC2 and XRCC3 expression in different differentiation gastric carcinoma

3 討 論

錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的功能是修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，維持基因組的完整性和穩(wěn)定性。hMSH2 是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中的重要成員之一[4]。目前認(rèn)為錯(cuò)配修復(fù)基因hMSH2在執(zhí)行錯(cuò)配修復(fù)時(shí)分別與hMSH6和hMSH3構(gòu)成異源二聚體hMutSα和hMutSβ，識(shí)別堿基錯(cuò)配，啟動(dòng)修復(fù)反應(yīng)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)癌組織hMSH2蛋白有很高的表達(dá)。這些蛋白可能是hMSH2基因突變后產(chǎn)生的無(wú)功能蛋白，使突變的癌基因和抑癌基因不能有效修復(fù)，基因突變積累，導(dǎo)致細(xì)胞癌變；也可能是組織癌變后，細(xì)胞增殖過(guò)快，DNA錯(cuò)配增多而導(dǎo)致的該蛋白反應(yīng)性增高。癌組織hMSH2蛋白表達(dá)明顯高于癌旁及非癌患者胃黏膜，因此檢測(cè)hMSH2蛋白的表達(dá)可能會(huì)有助于胃癌的診斷。

表3 hMSH2與MGMT、XRCC2、XRCC3表達(dá)的關(guān)系Tab 3 Correlation among hMSH2 to MGMT，XRCC2，XRCC3

1)與癌組織中hMSH2陰性組相比，P<0.05

MGMT蛋白主要修復(fù)烷化劑導(dǎo)致的DNA損傷,其中最主要的是甲基化。該蛋白的半胱氨酸是烷基受體,可將鳥(niǎo)嘌呤O6位上甲基轉(zhuǎn)移給自身,從而修復(fù)DNA 的甲基化[6,7]，保護(hù)染色體免受烷化劑的致突變作用和致癌作用的損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癌組織和癌旁黏膜MGMT蛋白的表達(dá)明顯降低，這可能由于該蛋白表達(dá)過(guò)低不足以修復(fù)烷化劑導(dǎo)致的DNA損傷，損傷積累，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。因此，MGMT蛋白的低表達(dá)可能是胃癌發(fā)生的原因。癌旁黏膜與癌組織處于同一個(gè)體,有著相同遺傳背景,受到相同的環(huán)境刺激,可能也有相近基因突變的積累,可被看作腫瘤易發(fā)生組織。癌旁黏膜出現(xiàn)MGMT蛋白表達(dá)降低的結(jié)果提示，具有該蛋白低表達(dá)的胃黏膜可能易發(fā)生癌變。MGMT蛋白低表達(dá)可能是胃黏膜癌變的組織學(xué)預(yù)警標(biāo)志。

XRCC2基因位于人類染色體的7q36.1 ,可以編碼含280個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。XRCC3基因位于人類染色體的14q32.3,可以編碼含800個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[8]。XRCC2 和XRCC3蛋白可以促進(jìn)RAD51 介導(dǎo)的解螺旋以及單鏈交換，修復(fù)DNA雙鏈斷裂，維持基因組的穩(wěn)定[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癌組織XRCC2和XRCC3蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁及非癌患者胃黏膜。這兩種蛋白的表達(dá)增高提示胃癌中存在DNA雙鏈斷裂的損傷形式，這種損傷可能是胃癌發(fā)生的原因之一。由此可見(jiàn)，XRCC2或XRCC3蛋白表達(dá)上調(diào)對(duì)胃癌診斷具有一定意義。

hMSH2、MGMT、XRCC2及XRCC3蛋白的表達(dá)在不同分化程度胃癌間均未見(jiàn)明顯差異，提示DNA損傷對(duì)胃癌分化程度影響不大。

錯(cuò)配修復(fù)基因修復(fù)的是DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，而損傷直接逆轉(zhuǎn)修復(fù)的是DNA復(fù)制后一些原因造成的DNA損傷，兩種修復(fù)方式作用時(shí)段不同。目前，關(guān)于hMSH2蛋白與MGMT蛋白表達(dá)關(guān)系的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織hMSH2蛋白陽(yáng)性組MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯高于hMSH2蛋白陰性組。此結(jié)果提示，癌組織hMSH2蛋白高表達(dá)的同時(shí)伴有MGMT蛋白的高表達(dá)?？梢酝茰y(cè)，內(nèi)外界很多因素致使hMSH2基因突變后不能有效的修復(fù)DNA復(fù)制時(shí)的堿基錯(cuò)配，使基因組不穩(wěn)定，甲基化可能增多。MGMT蛋白為了修復(fù)這些異常的甲基化而代償性增高。

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