Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的干細(xì)胞治療

孫默萱，孫文長(zhǎng)

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是中國(guó)最常見的X連鎖隱性遺傳肌病，發(fā)病率約3/10萬活男嬰，女性為致病基因的攜帶者，所生男孩50%發(fā)病。臨床特征主要為緩慢進(jìn)行性加重的對(duì)稱性肌肉無力和萎縮，無感覺障礙。通常3～5歲隱性起病，大多數(shù)患者伴有心肌損害，約30%患兒有不同程度的智能障礙?；純阂话?2歲起不能行走，需坐輪椅，晚期患者因呼吸肌萎縮，多數(shù)在20多歲因呼吸道感染，心力衰竭而死亡[1]。

DMD的基因位于染色體Xp21，該基因跨度2300 kb，是已發(fā)現(xiàn)的人類最大基因，cDNA長(zhǎng)14 kb，編碼3685個(gè)氨基酸，組成427 kD的抗肌萎縮蛋白。該細(xì)胞骨架蛋白位于骨骼肌和心肌細(xì)胞的質(zhì)膜面，具有細(xì)胞支架、抗?fàn)坷?、防止肌?xì)胞膜在收縮活動(dòng)時(shí)撕裂的功能。DMD患者因基因缺陷而使肌細(xì)胞內(nèi)缺乏抗肌萎縮蛋白，造成肌細(xì)胞膜不穩(wěn)定并導(dǎo)致肌細(xì)胞壞死和功能缺失[1]。

目前,沒有有效措施來防止DMD癥狀出現(xiàn)或阻止病情惡化。針對(duì)DMD主要采取對(duì)癥治療及支持療法，如增加營(yíng)養(yǎng)，使用ATP及維生素E等。多年來，人們一直在努力探索，尋找根治的有效方法。

1 干細(xì)胞的概要

干細(xì)胞(stem cell)是通過細(xì)胞分裂可以自我更新、并能分化產(chǎn)生特定細(xì)胞的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞分化潛能較大，在一定條件下可分化為機(jī)體任何一種組織器官，而成體干細(xì)胞分化潛能較小，其存在于成熟個(gè)體各種組織器官中，通常只能分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，如肌肉干細(xì)胞。不同類型的干細(xì)胞已被用于肌肉萎縮動(dòng)物模型(mdx小鼠)中，以合成抗肌萎縮蛋白，修復(fù)部分病理組織[2,3]。

2 干細(xì)胞治療

2.1 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞

肌肉“衛(wèi)星細(xì)胞”位于骨骼肌纖維基板下，緊鄰漿膜，其中的前體細(xì)胞參與肌肉的生長(zhǎng)和修復(fù)。具有以下表面標(biāo)記的(CD45-Sca-1-Mac-1-CXCR4+β1-integrin+，CSM4B)的骨骼肌前體細(xì)胞可以分化為肌肉細(xì)胞，而mdx小鼠的此種骨骼肌細(xì)胞前體數(shù)目減少。從衛(wèi)星細(xì)胞池中純化了CSM4B骨骼肌細(xì)胞前體，植入抗肌萎縮蛋白缺如的mdx小鼠，這些細(xì)胞前體可以分化成肌纖維，使抗肌萎縮蛋白表達(dá)，降低了肌肉炎癥和纖維化，明顯提高了收縮功能。移植的骨骼肌細(xì)胞前體也進(jìn)入衛(wèi)星細(xì)胞區(qū)，更新了內(nèi)源性干細(xì)胞池并加入隨后的損傷修復(fù)中。有一些衛(wèi)星細(xì)胞不僅具有分化功能，同時(shí)能進(jìn)行自我更新[4]，具有骨骼肌干細(xì)胞功能，因此骨骼肌能終身執(zhí)行修復(fù)功能并且始終保持衛(wèi)星細(xì)胞池穩(wěn)定。此種干細(xì)胞對(duì)其他肌肉的損傷也有良好的治療前景。

在肌肉生長(zhǎng)的不同時(shí)期，細(xì)胞表面標(biāo)志物也各不相同。Pax基因是肌肉生長(zhǎng)的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，Pax3和Pax7決定早期肌肉形成，Pax3的持續(xù)表達(dá)是生成骨骼肌細(xì)胞前體的關(guān)鍵步驟[5]，在轉(zhuǎn)錄因子Eya2、Six1和Dach2的協(xié)助下激活Myf5使其表達(dá)[6]。肌源性調(diào)節(jié)因子Myf5、Myf6、MyoD和肌細(xì)胞生長(zhǎng)素等是一系列調(diào)節(jié)肌肉生成的基礎(chǔ)，Myf5、Myf6、MyoD對(duì)骨骼肌的發(fā)育尤其重要，三者均突變的胚胎完全沒有成肌細(xì)胞和骨骼肌纖維，對(duì)突變物種的進(jìn)一步遺傳分析發(fā)現(xiàn)，在調(diào)控骨骼肌發(fā)育過程中，Myf5和Myf6是MyoD的上游調(diào)節(jié)因子[7]。研究證實(shí)，將衛(wèi)星細(xì)胞在體外培養(yǎng)使其分化能力降低[8]，對(duì)疾病的治療不利。因此，在選擇并分離合適的骨骼肌干細(xì)胞時(shí)應(yīng)選擇高分化潛能的Pax3/7++細(xì)胞。

2.2 成血管細(xì)胞

目前，實(shí)驗(yàn)多采用小鼠為研究對(duì)象，但小鼠并不能展現(xiàn)出此種疾病的全部臨床特征。為了進(jìn)一步向臨床應(yīng)用，必須論證干細(xì)胞移植在大型肌肉萎縮動(dòng)物模型中的有效性。GRMD(Golden retriever muscular dystrophy)狗嚴(yán)重缺乏抗肌萎縮蛋白，不僅影響肢體、呼吸肌和心肌功能，而且累及咽肌，使消化功能嚴(yán)重受損[9]。當(dāng)與 C2C12小鼠的肌母細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染 MyoD時(shí)，狗的外源性野生型成血管細(xì)胞(mesoangioblast)分化形成了多核肌管。為了檢測(cè)干細(xì)胞治療或基因療法的有效性，在不同程度免疫抑制下，研究者將自身抗肌萎縮蛋白基因更正的成血管細(xì)胞和外源性野生型成血管細(xì)胞分別植入兩個(gè)GRMD狗試驗(yàn)組，并設(shè)立對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，外源性野生型成血管細(xì)胞使得受試對(duì)象大量表達(dá)抗肌萎縮蛋白，肌纖維得以重建，肌肉收縮功能明顯增強(qiáng)，甚至能恢復(fù)正常的行走功能。而經(jīng)過基因更正的成血管細(xì)胞輸回自體產(chǎn)生的治療效果相對(duì)較差[7]。在使用外源性野生型成血管細(xì)胞治療的實(shí)驗(yàn)組中，66.7%受試對(duì)象表現(xiàn)出明顯的功能增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果失敗的2只狗，其中1只死于突發(fā)的心臟病，另一只由于注射的外源性野生型成血管細(xì)胞的量過少。而功能增強(qiáng)的4只狗中，有2只直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束都始終保持著良好的運(yùn)動(dòng)功能，而另外2只在一段時(shí)間后便失去了行走功能。對(duì)于這種現(xiàn)象還不能給出明確的解釋，不同受試對(duì)象間存在的很大變異性，也許與在接受移植細(xì)胞后機(jī)體的免疫抑制程度不同有關(guān)。這些推斷直接關(guān)系到將來的臨床試驗(yàn)，作者建議臨床患者使用的供體細(xì)胞應(yīng)來源于HLA配型一致的捐贈(zèng)者[7]。

2.3 干細(xì)胞與基因治療相結(jié)合

已有數(shù)據(jù)表明，表達(dá)CD133表面標(biāo)志物的人類血液源性細(xì)胞前體，能分化形成肌纖維。提取表達(dá)CD133的人類肌營(yíng)養(yǎng)不良血液源性和肌肉源性干細(xì)胞，采用外顯子跳躍技術(shù)糾正原有的基因缺陷，可以產(chǎn)生有功能的抗肌萎縮蛋白，是一種將基因治療與干細(xì)胞治療相結(jié)合的療法[10]。先分離DMD CD133+細(xì)胞并感染慢病毒載體，該載體攜帶用以剔除外顯子51的反義寡核苷酸，可在前體細(xì)胞中表達(dá)短一些但仍有功能的人類抗肌萎縮蛋白。有肌肉再生潛能的血液源性CD133+干細(xì)胞已在前面的工作中被證實(shí)，此次展示了肌肉源性CD133+干細(xì)胞也有向肌肉和內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力。剔除外顯子51可以糾正原始閱讀框架移位，在外顯子48和52之間表達(dá)正確的閱讀框。剔除后的血液源性和肌肉源性干細(xì)胞能在體內(nèi)融入肌纖維，不僅表達(dá)功能性人類抗肌萎縮蛋白，而且質(zhì)膜再表達(dá)α和β肌糖蛋白證實(shí)了抗肌萎縮蛋白相關(guān)的蛋白復(fù)合體得以重建，它們可以分化成為肌營(yíng)養(yǎng)不良骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的衛(wèi)星細(xì)胞。然而，在肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的肌肉內(nèi)注射這些干細(xì)胞只能使周圍部分肌纖維得以再生，為了解決這個(gè)問題，研究者嘗試著在血管內(nèi)注射干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分受損肌肉不僅在形態(tài)上得以糾正，功能也達(dá)到了正常水平。此種方法使用患者自身的干細(xì)胞，減少了移植的免疫排斥反應(yīng)。外顯子跳躍技術(shù)不僅用于骨骼肌糾正原有的基因缺陷，同樣也成功地應(yīng)用于糾正mdx小鼠的心肌基因缺陷，取得了良好的效果[11]。另有研究顯示，將含小型化抗肌萎縮蛋白的慢病毒導(dǎo)入新生mdx小鼠，蛋白表達(dá)可長(zhǎng)達(dá)2年，受轉(zhuǎn)化的肌肉干細(xì)胞可參與肌肉的再生[12]。但將細(xì)胞療法與基因療法相結(jié)合，也帶來了其它問題，尤其是生物安全性問題，可長(zhǎng)期表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒在細(xì)胞染色體的整合干擾了機(jī)體對(duì)一些持家基因、癌基因或腫瘤抑制基因的控制，可能增加腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)此需謹(jǐn)慎考慮。因此，人們又嘗試了電轉(zhuǎn)移抗肌萎縮蛋白質(zhì)粒DNA至肌肉細(xì)胞，以避免逆轉(zhuǎn)錄病毒整合至宿主染色體的危險(xiǎn)[13]。

2.4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與人工染色體

干細(xì)胞治療中的一個(gè)難題是移植細(xì)胞的免疫排斥問題。最近，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell)的出現(xiàn)，給這個(gè)問題的解決帶來了新的手段。將患者的成纖維細(xì)胞分離，導(dǎo)入Klf4,Sox2,Oct4,c-Myc 等因子，使之成為患者特異的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，再誘導(dǎo)分化成所需要的組織細(xì)胞，移植入患者體內(nèi)，這樣可有效地避免移植物的免疫排斥問題[14-16]。研究人員已利用患者的成纖維細(xì)胞先導(dǎo)入含DMD基因組的人工染色體，糾正其基因缺欠，再將已糾正的成纖維細(xì)胞制備成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，最后分化成表達(dá)抗肌萎縮蛋白的肌肉干細(xì)胞[17]。從干細(xì)胞批量誘導(dǎo)形成肌肉細(xì)胞的方法也已經(jīng)建立[18,19]。結(jié)果顯示，人工染色體表達(dá)穩(wěn)定，相對(duì)于慢病毒，無插入突變的危險(xiǎn)[20]，患者特異的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞又可避免移植細(xì)胞的免疫排斥問題，因此，這種途徑在臨床上將有較好的應(yīng)用前景。

3 展 望

具有自我更新、自我分化能力的干細(xì)胞在Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了預(yù)期的良好結(jié)果。但考慮到從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體應(yīng)用的復(fù)雜性及一系列體內(nèi)環(huán)境因素的影響，在其成為臨床治療方案之前仍需要積極探索，不斷完善。干細(xì)胞療法與基因治療的結(jié)合有望在臨床治療中取得良好效果。

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