山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)基因多態(tài)性研究

張智浩，宋永紅，張 毅，聶向民，莊云龍，朱傳福

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044； 2.山東省血液中心，山東 濟(jì)南 250014)

人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte Antigen,HLA)是迄今為止人類基因組中最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性和免疫多態(tài)性基因體系，它位于6P21.3，其中的HLA-A、B、DRB1是基因多態(tài)性最高的3個(gè)HLA基因座?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4000多個(gè)等位基因[1,2]，并具有顯著的人種、民族、地域差異[3]，也是人類遺傳學(xué)的一個(gè)重要遺傳標(biāo)志。同時(shí)，在醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域均具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值[4]。HLA的多態(tài)性取決于其基因的堿基序列，所以用分子生物學(xué)技術(shù)直接從基因水平對(duì)HLA基因多態(tài)性進(jìn)行分析，方法準(zhǔn)確，已在骨髓庫和臨床廣泛使用[5]。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核酸探針(PCR-SSOP)方法對(duì)山東臨沂地區(qū)造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者進(jìn)行HLA-A、B、DRB1基因分型，分析山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA分布特點(diǎn)，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 分析對(duì)象

2009年1～12月山東臨沂地區(qū)健康、無血緣關(guān)系的漢族造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者4035人，抽取EDTA抗凝全血5 mL。

1.2 主要試劑和儀器

Qiagen DNA提取試劑盒，Onelambda 公司的LABType SSO試劑盒，GeneQuant Pro 核酸蛋白濃度測(cè)定儀(美國(guó)Amersham Biosciences)，ABI9700 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI)，Genegenius凝膠成像儀(美國(guó)Gene公司)和luminex100 分析儀。

1.3 分型方法

(1)提取全血中的DNA，DNA濃度30～150 ng/μL A值260/280比值等于1.6～1.9。(2)擴(kuò)增DNA，PCR擴(kuò)增條件嚴(yán)格按照說明書操作。(3)電泳，取5～8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳15 min，紫外成像儀觀察拍照。(4)采用PCR-SSOP流式磁珠分型方法，獲得HLA-A、B、DRB1的分型結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)4035例獻(xiàn)血者HLA-A、B、DRB1的分型結(jié)果，用直接計(jì)算方法計(jì)算其等位基因頻率。不同地區(qū)間的比較使用2×2表格法，χ2=(ad-bc)2*n/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)，其中n=a+b+c+d[6]，以P<0.005判斷基因頻率的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率

本組共檢出18種HLA-A等位基因，32種HLA-B等位基因，13種HLA-DRB1等位基因。其中，HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率高于10%的分別是：A*02(27.3978%)、A*24(14.624%)、A*11(14.2131%)、A*30(11.5861%)、A*33(11.5613%)、B*13(15.8736%)、B*15(12.9864%)、B*40(11.5118%)、DRB1*15(18.3271%)、DRB1*07(15.3160%)、DRB1*04(10.7683%)。見表1。

2.2 山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率分別與其它地區(qū)的漢族人群比較結(jié)果

選取山東臨沂地區(qū)漢族人群的HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率前8位分別與遼寧省漢族人群、山東省漢族人群、重慶市漢族人群以及海南省漢族人群進(jìn)行比較。結(jié)果見表2。

山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A位點(diǎn)等位基因頻率與遼寧地區(qū)漢族人群比較， A*33、A*30、A*11、A*24、A*02等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與山東地區(qū)漢族人群比較， A*30、A*33、A*02等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與重慶地區(qū)漢族人群比較中的A*11、A*30、A*33、A*03、A*01、A*31等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與海南地區(qū)漢族人群比較中A*02、A*24、A*11、A*30、A*33、A*03、A*01、A*31等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)。

山東臨沂地區(qū)漢族人群與遼寧地區(qū)漢族人群相比， HLA-B*13、B*15、B*40、B*44、B*07、B*46等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與山東地區(qū)漢族人群比較中的HLA-B*13、B*40、B*07等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與重慶地區(qū)漢族人群比較中的HLA-B*13、B*40、B*07、B*58、B*46等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與海南地區(qū)漢族人群比較中HLA-B*13、B*40、B*51、B*44、B*07、B*58、B*46等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)。

表1 山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率Tab 1 Allele frequency of HLA-A、B、DRB1 locus in Shandong Linyi Han population

基因型實(shí)測(cè)等位基因數(shù)基因頻率(%)B?37730．9046B?381752．1685B?391361．6853B?4092911．5118B?41130．1611B?4240．0496B?445196．4312B?45150．1859B?464075．0434B?4750．0620B?482533．1351B?49200．2478B?50590．7311HLA-DRB1DRB1?012533．1351DRB1?033254．0273DRB1?0486910．7683DRB1?07123615．3160DRB1?084936．1090DRB1?097989．8885DRB1?10941．1648DRB1?114215．2169DRB1?127669．4919DRB1?136838．4634DRB1?144525．6010DRB1?15147918．3271DRB1?162012．4907

山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-DRB1位點(diǎn)等位基因頻率與遼寧地區(qū)漢族人群比較中的DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與山東地區(qū)漢族人群比較中的 DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*13等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與重慶地區(qū)漢族人群比較中的DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與海南地區(qū)漢族人群比較中DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)。

3 討 論

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因定位于6號(hào)染色體短臂上,長(zhǎng)約3600 kb，是機(jī)體內(nèi)特異性免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答的主要成分，在遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)和移植免疫中起著非常重要的作用。序列特異性寡核苷酸探針聚合酶鏈反應(yīng) (PCR-Sequence Specific Oligonucleotide Probe，PCR-SSOP)分型技術(shù)是目前最常用、認(rèn)可度最高的基因分型技術(shù)。與傳統(tǒng)方法相比較，PCR-SSOP法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，可用于其他技術(shù)不易分辨的等位基因的檢測(cè)及位點(diǎn)的鑒定。

通過對(duì)4035名山東臨沂地區(qū)漢族造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者HLA-A、B、DRB1基因分型結(jié)果的調(diào)查研究，揭示了山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRB1基因多態(tài)性的特征。本次抽樣調(diào)查共檢出HLA-A位點(diǎn)等位基因18種，HLA-B位點(diǎn)等位基因32種，HLA-DRB1位點(diǎn)等位基因13種。其中，比較常見的分別為A*02、A*24、A*11、A*30、A*33、B*13、B*15、B*40、B*51、B*44、DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、CRB1*12。A*36、A*83、B*82、B*83是全世界都非常罕見的等位基因，本次未測(cè)到[13]。中國(guó)漢族人群可分為南、北方兩大主要人群，其中北方人群HLA-A位點(diǎn)高頻率等位基因依次是：A*02、A*11、A*24、A*33和A*30；HLA-B位點(diǎn)是：B*13、B*15(62)、B*40(60)、B*51以及B*46；HLA-DRB1位點(diǎn)依次是：DRB1*15、DRB1*09、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*12。中國(guó)南方人群HLA-A位點(diǎn)高頻率等位基因依次是：A*11、A*02、A*24、A*33以及A*30；HLA-B位點(diǎn)是：B*40(60)、B*46、B*13、B*58和B*15(75)；HLA-DRB1位點(diǎn)是：DRB1*09、DRB1*15、DRB1*12、DRB1*04以及DRB1*08[5],山東臨沂地區(qū)漢族人群總體體現(xiàn)了中國(guó)北方漢族的特點(diǎn)。

表2 山東臨沂地區(qū)漢族人群HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率分別與其他地區(qū)的漢族人群比較結(jié)果Tab 2 Comparision of HLA-A,B,DRB1 allele frequency between Shandong Linyi Han and other Han population

1)與山東臨沂地區(qū)漢族人群等位基因頻率比較，P<0.005

山東臨沂地區(qū)漢族人群與遼寧省漢族人群HLA位點(diǎn)等位基因分布頻率比較，HLA-A*33、A*30、A*02、B*13、B*07、B*40、DRB1*09、DRB1*07、DRB1*13等差異有顯著性意義；HLA-A*33、A*02、A*30、B*13、B*07、B*40、DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09等與山東省漢族人群等位基因分布頻率差異有顯著性意義；與重慶地區(qū)漢族人群等位基因分布頻率比較：A*11、A*33、A*30、B*46、B*07、B*13、DRB1*14、DRB1*15、DRB1*07等位點(diǎn)差異有顯著性意義；A*30、A*11、A*01、B*44、B*46、B*07、DRB1*07、DRB1*13、DRB1*15等位點(diǎn)與海南省漢族人群的等位基因分布頻率特點(diǎn)有明顯不同。

山東臨沂地區(qū)漢族人群與其他地區(qū)漢族人群的比較，HLA等位基因頻率均出現(xiàn)了比較明顯的差異。但與北方的漢族人群還是基本相似，與南方的漢族人群有明顯的差異。與山東地區(qū)漢族人群亦有較大的差異。另外，在作者報(bào)道的6個(gè)新HLA等位基因中，源于臨沂地區(qū)的就有兩個(gè)，分別為HLA-B*4086和HLA-B*4096[14,15]，說明HLA等位基因的分布在省內(nèi)也有地域性的差異。

至2010年5月已報(bào)道有4000多個(gè)等位基因并且仍在不斷發(fā)現(xiàn)新的基因[16,17]。而本研究從HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)等位基因頻率的分布差異看出，可以在中國(guó)建立造血干細(xì)胞資料庫的重要性和必要性。建立適合本地區(qū)和本民族的造血干細(xì)胞資料庫，對(duì)了解HLA等位基因的多態(tài)性分布和基因頻率的研究以及對(duì)某些疾病的診斷有重要的意義，也會(huì)提高器官移植者相合的幾率。本研究也為山東臨沂地區(qū)漢族人群的HLA等位基因相關(guān)性研究提供了有意義的參考數(shù)據(jù)。

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