多重PCR-CE用于血小板抗原HPA-2、-3、-15基因分型的研究

劉 銘，周世航

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044； 2.大連市血液中心，遼寧 大連 116001)

血小板特異性抗原(human platelet antigens，HPA)又稱血小板抗原，是位于血小板膜上的糖蛋白。目前，通過血清學(xué)方法已確認(rèn)了24個(gè)HPA，其中的12個(gè)被分成6個(gè)HPA系統(tǒng)(HPA-1～5、15)。迄今，24個(gè)HPA中的22個(gè)HPA的分子基礎(chǔ)已經(jīng)得到了闡明。除了HPA-14bw外，其它均由于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)導(dǎo)致的單個(gè)氨基酸改變而產(chǎn)生的[1]。臨床上，在血小板輸注或懷孕過程中，如果血小板同種抗原不合，可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體，引起同種免疫血小板減少綜合征，如新生兒同種免疫血小板減少性紫癜、輸血后紫癜、血小板輸注無效等[2]。此外，HPA的基因頻率在不同種族人群中的分布有一定的差異[3,4]。因此，對HPA進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的分型在臨床和輸血醫(yī)學(xué)以及遺傳學(xué)和人類學(xué)研究中均有著十分重要的意義。

隨著對HPA的分子生物學(xué)特征的進(jìn)一步認(rèn)識以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多分子生物學(xué)方法，開始應(yīng)用于HPA的基因分型。本研究聯(lián)合應(yīng)用多重PCR和高分辨率的毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)建立了一個(gè)用于HPA -2、-3、-15系統(tǒng)基因分型的多重PCR-CE方法，并調(diào)查了大連地區(qū)獻(xiàn)血人群中HPA -2、-3、-15系統(tǒng)的基因型和基因頻率。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

隨機(jī)選取大連市血液中心的100名獻(xiàn)血者，均為漢族無血緣關(guān)系個(gè)體。每例采集血樣2 mL于-20℃保存。

1.2 主要試劑和儀器

PCR試劑盒、去離子甲酰胺、GeneScan500[ROX]購自美國Applied Biosystem公司；血液DNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司； DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；TP-600型PCR擴(kuò)增儀 購自寶生物工程(大連)有限公司； ABI PRISM 310 Genetic Analyzer 購自美國Applied Biosystem公司。

1.3 血樣DNA提取

使用DNA提取試劑盒(鹽析法)，提取血樣DNA。

1.4 引物合成

引物由寶生物工程(大連)有限公司合成并進(jìn)行熒光標(biāo)記。多重PCR引物序列見表1。

表1 多重PCR引物Tab 1 Primers for multiplex PCR

1.5 PCR-SSP

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括100 ng DNA、0.4 μmol/L HPA分型引物、0.2 μmol/L內(nèi)對照引物、500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl(PH8.3)、1.5 mmol/L MgCl2、200 mmol/L dNTP、1 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase。 PCR反應(yīng)條件： 預(yù)變性，95℃,10 min；然后，變性，95℃,30 s，退火，60℃,30 s， 延伸，72℃,90 s，共30個(gè)循環(huán)；最后一次延伸 72℃,5 min[4]。

1.6 多重PCR

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括100 ng DNA、0.4～1.0 μmol/L HPA分型引物、500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1.5 mmol/L MgCl2、200 mmol/L dNTP、1 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃,10 min；然后，變性，95℃,30 s退火，60℃,30 s， 延伸，72℃,90 s，共30個(gè)循環(huán) ；最后一次延伸 72℃,5 min。

1.7 毛細(xì)管電泳

取1 μL PCR產(chǎn)物(1∶10稀釋)與24 μL去離子甲酰胺和1 μL GeneScan500[ROX]混合，95℃變性5 min，然后立即冰浴3 min，轉(zhuǎn)至樣品管中，在ABI PRISM 310 Genetic Analyzer上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。電泳凝膠為POP4 polymer,毛細(xì)管47 cm(長)×50 μm(內(nèi)徑)。所用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)為GeneScan 500 [ROX]，該條件下可檢測峰片段長度分別為：75、100、140、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500 bp。PCR產(chǎn)物為藍(lán)色峰，而內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)顯示為紅色峰。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率。 采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)以及不同地區(qū)的人群基因頻率比較。統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 11.5，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 多重PCR-CE基因分型

100名獻(xiàn)血者HPA -2、-3、-15系統(tǒng)的多重PCR-CE基因分型結(jié)果見表2。結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡。圖1是1例樣本的多重PCR-CE基因分型圖譜。

表2 大連地區(qū)100名獻(xiàn)血者的HPA -2、-3、-15系統(tǒng)的基因分型Tab 2 Genotyping of HPA-2,-3 and -15 in 100 Dalian donors

圖1 1例樣本的多重PCR-CE基因分型Fig 1 Genotyping of one sample using multiplex PCR-CE1:HPA-15b; 2:HPA-15a; 3:HPA-3b;4:HPA-3a;5:HPA-2b;6:HPA-2a;樣本的基因型:HPA-2ab、HPA-3ab、HPA-15ab

2.2 多重PCR-CE與PCR-SSP的比較

為了驗(yàn)證多重PCR-CE的準(zhǔn)確性，同時(shí)也使用常規(guī)的PCR-SSP方法，對100名獻(xiàn)血者的樣本進(jìn)行HPA -2、-3、-15系統(tǒng)基因分型。結(jié)果表明，這兩個(gè)方法的基因分型結(jié)果是完全一致的。圖2是1例樣本的PCR-SSP基因分型圖譜。

圖2 1例樣本的PCR-SSP基因分型Fig 2 Genotyping of one sample using PCR-SSP樣本的基因型:HPA-2aa、HPA-3aa、HPA-15ab

2.3 大連地區(qū)漢族人群HPA -2、-3、-15系統(tǒng)等位基因頻率與國內(nèi)部分地區(qū)人群比較

大連地區(qū)漢族人群與國內(nèi)山東、上海、浙江漢族人群相比，HPA -2、-3、-15系統(tǒng)等位基因頻率差異無顯著性意義(P>0.05)；與新疆維吾爾族相比，HPA -2、-3系統(tǒng)等位基因頻率差異無顯著性意義(P>0.05)，而HPA-15系統(tǒng)等位基因頻率差異有顯著性意義(P<0.05)。見表3。

3 討 論

在HPA各個(gè)系統(tǒng)中，從本質(zhì)來說，除了HPA-14bw外，HPA均是由SNP引起的。因此，用于SNP分型的各種方法也適用于HPA的基因分型。目前，用于HPA系統(tǒng)基因分型的方法眾多，包括聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)[3,4]、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)[9]、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)[10]、熔解曲線分析法[11,12]、TaqMan探針實(shí)時(shí)PCR[13]、置換探針多色實(shí)時(shí)PCR[14]以及基因芯片[15]等方法。以上方法中，PCR-SSP是目前應(yīng)用最廣泛的HPA基因分型方法。雖然PCR-SSP應(yīng)用較廣，但是該方法對于每個(gè)HPA系統(tǒng)的一對等位基因，需要進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)，才能完成基因分型。

為了克服PCR-SSP檢測通量低的缺點(diǎn)，本研究聯(lián)合使用了多重PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)。首先，對常規(guī)PCR-SSP方法進(jìn)行了改進(jìn)。利用引物的5’端的序列不影響PCR擴(kuò)增的特點(diǎn)，在部分引物的5’端加上5個(gè)堿基，再將HPA -2、-3、-15系統(tǒng)的分型引物，置于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行多重PCR。HPA -2、-3、-15系統(tǒng)的6個(gè)等位基因，經(jīng)多重PCR后,將產(chǎn)生片段長度不同的等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物。然后使用高分辨率的毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行基因片段長度掃描，根據(jù)產(chǎn)物片段長度的大小而進(jìn)行血小板抗原基因分型。為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)使用建立的多重PCR-CE和常規(guī)的PCR-SSP方法對100名獻(xiàn)血者進(jìn)行HPA -2、-3、-15的基因分型。結(jié)果表明，二者的分型結(jié)果是完全一致的。

表3 大連地區(qū)漢族人群HPA -2、-3、-15系統(tǒng)等位基因頻率與國內(nèi)部分地區(qū)人群比較Tab 3 Comparison of gene frequencies of HPA-2,-3 and -15 in Dalian Han populations with that in other Chinese populations

1)與大連漢族相比，P<0.05

本研究建立的多重PCR-CE方法，可以同時(shí)檢測HPA系統(tǒng)的6個(gè)等位基因，檢測通量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的PCR-SSP法。而且，進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測時(shí)，使用了自動化的毛細(xì)管電泳技術(shù)，既避免了瓊脂糖凝膠電泳的手工操作,也防止了DNA染色劑溴化乙錠對人體的危害。

本研究建立的多重PCR-CE方法只是對其中的HPA-2、-3、-15系統(tǒng)進(jìn)行基因分型。Feng等[3]的研究表明，在中國漢族隨機(jī)輸血人群中，HPA-15、-3、-2的不配合幾率分別為37.40%、36.59%、8.80%，要遠(yuǎn)高于其他HPA系統(tǒng)。因此，本研究建立的針對以上3個(gè)HPA系統(tǒng)的基因分型方法將有著極大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

HPA等位基因頻率調(diào)查在群體遺傳學(xué)和臨床輸血等方面，都有著十分重要的價(jià)值。國內(nèi)外一些研究表明，HPA等位基因頻率有一定種族分布特征[3,4]。本研究調(diào)查了大連地區(qū)漢族人群HPA -2、-3、-15的基因頻率，并與國內(nèi)部分地區(qū)人群進(jìn)行比較，結(jié)果表明大連地區(qū)漢族人群HPA-2、-3、-15的基因頻率和國內(nèi)其他地區(qū)漢族人群沒有差異。國內(nèi)的研究也證實(shí)，中國北方和南方漢族人群HPA-1～16的基因總體分布差異無顯著性意義[3]。但本研究也發(fā)現(xiàn)，大連地區(qū)漢族人群HPA-15的基因頻率和新疆維爾族人群有一定差異，這提示在國內(nèi)HPA-15等位基因分布存在著種族差異。

總之，本研究中建立了一個(gè)優(yōu)于PCR-SSP的簡單、快速、準(zhǔn)確、高通量的HPA -2、-3、-15基因分型方法，闡明了大連地區(qū)漢族人群HPA -2、-3、-15的基因分布特征。這對于保障血小板的輸注安全,提高血小板輸注療效,研究HPA與疾病的關(guān)系，建立已知HPA基因型血小板供者庫等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及群體遺傳學(xué)和人類學(xué)研究等方面均有著重要的意義。

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