電穿孔介導(dǎo)的可調(diào)控人胰島素基因肌肉轉(zhuǎn)染對糖尿病小鼠的降糖作用

劉海霞，李 鴻，張雪楊，蘇本利

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116027)

1型糖尿病的病因為體內(nèi)胰島素絕對缺乏，故體內(nèi)胰島素基因治療糖尿病始終為研究熱點，而安全高效的基因轉(zhuǎn)染手段及胰島素基因的表達調(diào)控則是基因治療成功的基本保障。作者采用強力霉素調(diào)控的Furin酶切胰島素原基因表達體系能夠?qū)崿F(xiàn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的Balb/C糖尿病小鼠依賴于強力霉素濃度的血糖控制[1],但實驗中作者發(fā)現(xiàn)小鼠后腿直接肌肉注射質(zhì)粒法轉(zhuǎn)移成功率較低。為此，本研究嘗試采用電穿孔法[2]進行該表達質(zhì)粒的小鼠后腿肌肉轉(zhuǎn)移，并與質(zhì)粒直接肌肉注射進行了對糖尿病小鼠的降糖作用比較。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑：質(zhì)粒pLNCX購自美國Clontech 公司，pINS-ABC(帶有furin酶切位點的重組人胰島素原基因)[3]由西班牙巴塞羅那大學(xué)獸醫(yī)院Fatima Bosch教授惠贈，pUHG102-8、pUHrT2-1(四環(huán)素抗性基因操縱子系統(tǒng))[4]由德國Heidelberg大學(xué)H.Bujard教授惠贈。鏈脲佐菌素(STZ)、強力霉素(doxcycline)及DEPC水均購自sigma公司。Trizol試劑購自 Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。RT-PCR所用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。DL-2000，λ-HindⅢ分子量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物工程(大連)有限公司。人胰島素ELISA試劑盒：購自美國BIOSOURCE公司，敏感度為0.15 μIU/mL,與人胰島素的交叉反應(yīng)為100%，與人胰島素原及大鼠胰島素的交叉反應(yīng)為0%。

1.1.2 主要器材：血糖儀及試紙(葡萄糖氧化酶法，美國羅氏公司)，DNA擴增儀(美國PE公司)，TS-B轉(zhuǎn)基因儀(北京醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Labsystems公司)，M-26型紫外光透照儀(美國)。

1.1.3 實驗動物：昆明種小鼠，200只，雄性，8～10周齡，體重(28±2) g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物飼養(yǎng)及實驗經(jīng)過大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 方 法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建、擴增和提?。篋NA重組技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS。其中，pUHG102-8為載體，rhINS序列來自pINS-ABC，rTA序列來自pUHrT2-1。質(zhì)粒總長9.3 kbp，包括2個方向相反的啟動子，Ptet4與PhCMV以3.3 kbp序列間隔。電轉(zhuǎn)至感受態(tài)大腸桿菌JM109中，堿裂解法提取質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法進行純化，并對插入的rhINS片段進行測序,委托寶生物工程(大連)有限公司完成[1]。

1.2.2 糖尿病小鼠模型的建立及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：200只昆明小鼠，留取10只正常健康小鼠行24 h禁食實驗，其余190只小鼠每只以120 mg/kg腹腔注射新鮮配制的1.5% STZ溶液(pH 4.1)。5 d后檢測隨機鼠尾末梢血糖≥16.67 mmol/L為成模，篩選血糖穩(wěn)定在26～32 mmol/L達2周者留做實驗。實驗小鼠分3組，第1組小鼠(42只)的兩側(cè)股部肌肉各注射質(zhì)粒prtTA-tet-INS 150 μg(總計300 μg)(胰島素電穿孔組，簡稱ET-ptetINS)；第2組小鼠(35只)的兩側(cè)股部肌肉各注射質(zhì)粒pLNCX 150 μg(總計300 μg)(空質(zhì)粒電穿孔對照組，簡稱ET-pLNCX)。第1、2組質(zhì)粒注射后5 min內(nèi)在注射部位兩側(cè)與注射平行方向插入兩根電極針(直徑0.2 mm,長度1.5 cm,兩針間距0.5 cm)并將其與轉(zhuǎn)基因儀連接,給予方波電脈沖刺激(電壓200 V/cm,波寬40 ms,脈沖次數(shù)6和頻率1 Hz)[2，5，6]。第3組小鼠(48只)的兩側(cè)股部肌肉各注射質(zhì)粒prtTA-tet-INS 150 μg(總計300 μg)(胰島素直接肌肉注射組，簡稱Nake-ptetINS)。各組轉(zhuǎn)染后立即給予濃度為2 mg/mL Dox水，每日稱體重，監(jiān)測鼠尾末梢血糖。

1.2.3 動物標(biāo)本的留取及檢測：轉(zhuǎn)染第14天，各組取3～4只小鼠，摘眼球取血，分離血清，保存于-20℃冰箱中；留取兩股肌肉、肝臟組織，保存于液氮中。

1.2.4 血清人胰島素檢測：按廠家提供說明書ELISA法檢測小鼠血清人胰島素。

1.2.5 小鼠肌肉組織中人胰島素原基因mRNA的提取及RT-PCR檢測：按廠家提供的方法用Trizol試劑提取肌肉、肝臟組織mRNA。以小鼠β-actin為內(nèi)參，上游引物:5'-AGCCTTCCTTCTTGGGTATG-3'，下游引物:5'-AACGCAGCTCAGTAACAGTC-3'，擴增片段長度為364 bp。根據(jù)質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS的rhINS片段設(shè)計引物，上游引物:5'-CGCAGCCTTTGTCAACCAAC-3'，下游引物:5'-CACAATGCCACGCTTCTGTC-3'，擴增片段長度為217 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min；1個循環(huán)。PCR反應(yīng)條件：94℃，2 min；1個循環(huán)；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；共35個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同基因轉(zhuǎn)移方法降糖效果及體重變化

胰島素基因經(jīng)兩種轉(zhuǎn)染方法均能在較長時間內(nèi)有效降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖，注射后第4天血糖較注射前下降，分別為電穿孔組(14.8±3.2) mmol/L，直接肌肉注射組(14.3±0.4) mmol/L，而不含胰島素原基因的質(zhì)粒pLNCX無降糖效果(-4.0±1.1) mmol/L。電穿孔組血糖平均降幅大于直接肌肉注射組為(14.7±0.77) mmol/L vs (12.2±3.0) mmol/L，P<0.01，小鼠隨機血糖降低在胰島素電穿孔組持續(xù)約9周，胰島素直接肌肉注射組持續(xù)約7周,且兩組質(zhì)粒停止表達后重復(fù)注射仍有效(圖1A)。胰島素電穿孔組與胰島素單純注射組小鼠體重處于恒定狀態(tài)，ET-pLNCX組小鼠體重具有下降趨勢，且于STZ誘導(dǎo)糖尿病成模后的4周內(nèi)死亡或被處死(圖1B)。

圖1 不同基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)染后各組糖尿病小鼠血糖水平及體重變化Fig 1 Changes in blood glucose level and weight of diabetic mice in different groupsA:各組糖尿病小鼠轉(zhuǎn)染后血糖水平，ET表示質(zhì)粒注射的時間?；疑珬l帶表示飲水中加入強力霉素的時間；B:各組小鼠的體重變化

2.2 各組小鼠血清人胰島素比較

直接肌肉注射(53.33±0.58) μIU/L及電穿孔 (55.67±1.37) μIU/L轉(zhuǎn)染prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒之后均使小鼠血清中人胰島素水平較空質(zhì)粒pLCNX轉(zhuǎn)染的糖尿病小鼠血清胰島素明顯升高(26.3±0.58)μIU/L，P<0.01。雖然血清人胰島素水平在胰島素電穿孔組較直接肌肉注射組略高，但兩者差異無顯著性意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 人胰島素原基因在小鼠肌肉組織中的表達

ET-ptetINS、Nake-ptetINS轉(zhuǎn)移后肌肉組織的mRNA通過RT-PCR均得到預(yù)期217 bp條帶，且前者在亮度上較后者略強(圖3A)。ET-ptetINS組肝臟組織的RT-PCR未擴增出特異條帶(圖3A)。

2.4 不同轉(zhuǎn)染方式的轉(zhuǎn)染有效率

圖2 各組小鼠血清真胰島素水平比較Fig 2 Comparison of serum human true insulin levels1：ET-ptetINS組； 2：ET-pLNCX組； 3：Nake-ptetINS組；與 ET-pLNC組比較， *P<0.01

圖3 RT-PCR檢測人胰島素原基因在各組小鼠不同組織中的表達結(jié)果
Fig 3 The RT-PCR results human proinsulin mRNA in muscle and liver of streptozotocin induced diabetic mice.
A：RT-PCR檢測人胰島素原基因在各組小鼠不同組織中的表達結(jié)果：1、7.DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)； 2.電穿孔轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pLNCX肌肉組織RT-PCR結(jié)果； 3.電穿孔轉(zhuǎn)染胰島素基因糖尿病小鼠肝臟組織RT-PCR結(jié)果； 4.胰島素基因直接肌肉注射組肌肉組織RT-PCR結(jié)果； 5.電穿孔轉(zhuǎn)染胰島素基因糖尿病小鼠肌肉組織RT-PCR結(jié)果； 6.質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS PCR結(jié)果。B:內(nèi)參β-actin RT-PCR結(jié)果：1.DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)； 2-5.與圖3A相對應(yīng)的糖尿病小鼠組織中β-actin RT-PCR結(jié)果

本研究比較了直接肌肉注射和電穿孔法轉(zhuǎn)移prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒后，成功表達并使血糖顯著下降的糖尿病小鼠的只數(shù)。電穿孔法的成功率與直接肌肉注射轉(zhuǎn)移法相比差異有顯著性意義(59.5% vs 12.5%，P<0.001)。42只小鼠進行了電穿孔法轉(zhuǎn)移胰島素基因，25只成功表達；48只小鼠進行了直接肌肉注射胰島素基因，只有6只小鼠成功表達。

2.5 電穿孔法基因轉(zhuǎn)移后小鼠24 h禁食血糖變化

為研究prTA-tet4-rhINS基因轉(zhuǎn)移后空腹?fàn)顟B(tài)下的血糖情況，對ET-ptetINS組、ET-pLNCX組及正常健康小鼠進行24 h禁食實驗(圖4)。禁食后，ET-ptetINS組血糖水平與正常健康小鼠血糖水平無明顯差別，為(5.2±1.2)mmol/L vs (4.9±0.2)mmol/L，沒有出現(xiàn)低血糖，而ET-pLNCX組血糖仍處于較高水平為(16.1±1.2)mmol/L。

圖4 電穿孔法基因轉(zhuǎn)移后小鼠24 h禁食血糖變化Fig 4 The effect on 24 hours fasting glucose after electroporation transfer of prTA-tet4-rhINS in diabetic mice.

3 討 論

實現(xiàn)胰島素基因治療糖尿病主要面臨兩個問題。其一，選擇一種安全高效的轉(zhuǎn)染方法，使胰島素基因能夠較為持久高效的在體內(nèi)表達，從而達到治療的目的；其二，鑒于生理情況下，胰島素的分泌是受葡萄糖調(diào)節(jié)感受器調(diào)控的，而導(dǎo)入體內(nèi)的胰島素基因的持續(xù)表達勢必會存在低血糖的危險，故胰島素基因的調(diào)控表達則成為治療的關(guān)鍵。本研究從這兩方面進行了探索。

電穿孔(electroporation或electropermeabilization) 近年來被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染，從而成為基因體內(nèi)導(dǎo)入非常有前途的手段之一[7-12]。它是指在外加短時電脈沖時，細(xì)胞膜雙脂層形成瞬時可復(fù)性微孔，使其通透性增強，從而正常情況下不能通過細(xì)胞膜的分子得以進出細(xì)胞的一種生物物理現(xiàn)象。其較病毒載體更為安全，較裸質(zhì)粒單純注射轉(zhuǎn)染率提高近1～2個指數(shù)倍，且降低了基因表達的個體差異。 Yin等[7]對非調(diào)控的胰島素基因轉(zhuǎn)移方面進行了有益的嘗試，效果良好，但沒有對直接肌肉注射和電穿孔法兩種基因轉(zhuǎn)移方法進行比較。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)是一種反式作用因子調(diào)控模式，1992年首先由Gossen和Bujard構(gòu)建成功。反式作用因子tTA/rtTA為一融合蛋白，兩者僅相差4個氨基酸，分別組成四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的兩種形式：tet-off和tet-on系統(tǒng)。tet-on系統(tǒng)中，四環(huán)素的存在使rtTA發(fā)生構(gòu)象變化，從而與四環(huán)素啟動子(Ptet)中的四環(huán)素操縱子(tetO)相結(jié)合使轉(zhuǎn)錄發(fā)生；而在tet-off系統(tǒng)中，加入四環(huán)素則使tTA與 Ptet分離，從而使轉(zhuǎn)錄中斷。本實驗采用的是tet-on系統(tǒng)，通過加入/撤除強力霉素(四環(huán)素的衍生物)，rtTA2-1特異、可逆地與Ptet結(jié)合、分離，從而作為一種轉(zhuǎn)錄開關(guān)調(diào)節(jié)基因的表達。本實驗中，為增加表達效率，在Ptet與PhCMV兩啟動子之間插入一段3.3 kbp序列，以使兩者互不干擾發(fā)揮最大作用。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的突出特點為：可產(chǎn)生階梯式、漸進性調(diào)控。另外，它來源于原核生物，不干擾真核生物基因組的表達。同時，其誘導(dǎo)物強力霉素(Dox)劑量相當(dāng)于其毒性劑量的1/300，故較為安全。目前，四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)已成功調(diào)控了多種基因的表達[13-15]，其安全、高效的特點已得到公認(rèn)。

為探索強力霉素調(diào)控的人胰島素原基因的安全有效的轉(zhuǎn)移手段，本研究應(yīng)用電穿孔法與質(zhì)粒肌肉直接注射兩種不同轉(zhuǎn)染方式對糖尿病小鼠的降糖作用的影響。結(jié)果顯示，兩種方法肌肉轉(zhuǎn)移后均使糖尿病小鼠血糖下降，體重穩(wěn)定增加，尿量減少，血清中檢測到較高水平真胰島素，兩組質(zhì)粒停止表達后重復(fù)注射仍有效。相比之下，直接注射組降糖作用7周，而電穿孔組更持久，降糖效果持續(xù)達9周；電穿孔組轉(zhuǎn)移成功率較直接肌肉注射更高(59.5% vs 12.5%)；電穿孔法基因轉(zhuǎn)移鼠間血糖變化標(biāo)準(zhǔn)差小，降低了基因表達的個體差異，雖然真胰島素水平在胰島素電穿孔組與直接肌肉注射組比較無顯著性意義(P>0.05)，但電穿孔法血清人胰島素似乎更高，為(55.67±1.37)μU/L vs (53.33±0.58)μU/L；RT-PCR顯示肌肉中mRNA水平人胰島素基因表達程度在胰島素電穿孔組較直接肌肉注射組稍強。ET-ptetINS組肝臟組織的RT-PCR未擴增出特異條帶，說明人胰島素原基因僅在注射部位的肌肉組織中表達。Martinenghi 等[16]采用人胰島素原電轉(zhuǎn)糖尿病小鼠骨骼肌能在6周內(nèi)有效控制糖尿病小鼠的高血糖，RT-PCR證實了胰島素在mRNA水平的表達，且體內(nèi)可檢測到較高水平的成熟胰島素(68.5±34.9)μU/L。本實驗得到了與上述一致的結(jié)果，且比較了兩種不同的基因轉(zhuǎn)移方法，與肌肉直接注射相比，電穿孔介導(dǎo)的質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS轉(zhuǎn)移基因表達持續(xù)時間更長久，表達水平更高，個體差異縮小，轉(zhuǎn)移率明顯提高。

本實驗應(yīng)用Tet-on系統(tǒng)實現(xiàn)了人胰島素原基因的表達，并獲得了較為理想的效果，進一步對電穿孔介導(dǎo)的胰島素基因轉(zhuǎn)染組行24 h禁食實驗。結(jié)果表明，禁食24 h后，該組小鼠血糖水平接近正常非糖尿病小鼠(5.2±1.2)mmol/L vs (4.9±0.2)mmol/L，且無低血糖發(fā)生，而注射pLNCX質(zhì)粒的小鼠血糖仍在較高水平(16.1±1.2)mmol/L，表明電穿孔介導(dǎo)的強力霉素調(diào)控的人胰島素原基因治療糖尿病小鼠具有較高的安全性。據(jù)此可推斷，Tet-on系統(tǒng)對于調(diào)控基因的背景表達或許可為糖尿病小鼠提供較為安全平穩(wěn)的基礎(chǔ)胰島素分泌。

總之，本實驗在胰島素基因治療的轉(zhuǎn)染手段與基因調(diào)控方面做一嘗試。結(jié)果表明電穿孔轉(zhuǎn)染率高，能使強力霉素調(diào)控的胰島素基因長期穩(wěn)定的表達，重復(fù)性好且操作簡便、安全，并以其獨特的優(yōu)越性成為基因治療中重要的轉(zhuǎn)染方法；而強力霉素調(diào)控的Tet-on系統(tǒng)雖然是一種非生理性調(diào)控系統(tǒng),但調(diào)控效果確實、可操作性強,這種調(diào)控系統(tǒng)將為胰島素基因的表達調(diào)控增加新的方式,它與電穿孔相聯(lián)合，必將開拓基因治療的新領(lǐng)域，為基因治療最終應(yīng)用于臨床提供理想的轉(zhuǎn)染手段與調(diào)控方式。

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