淡豆豉提取物對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的改善作用

牛麗穎， 王鑫國(guó)， 任艷青， 劉 姣， 李 清

(河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050091)

近年來(lái)植物雌激素對(duì)絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的防治備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，中藥淡豆豉有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性［1，2］，但其對(duì)骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用大鼠去卵巢的方法模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，通過(guò)觀察淡豆豉提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響，以進(jìn)一步明確其對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用，為開(kāi)發(fā)淡豆豉資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 淡豆豉，由本實(shí)驗(yàn)室在《中國(guó)藥典》(2005版)淡豆豉制法的基礎(chǔ)上，對(duì)其工藝參數(shù)進(jìn)行量化、優(yōu)選后炮制而成，成品經(jīng)石油醚(60～90℃)脫脂、8倍量70%乙醇回流提取(3次，每次2 h)、大孔樹(shù)脂純化，流出液濃縮至4 g生藥/mL，備用;仙靈骨葆膠囊，貴州同濟(jì)堂制藥有限公司。

1.1.2 儀器 Reicheit-Jung 2040切片機(jī)(德國(guó));Leica Qwin圖象分析系統(tǒng)(德國(guó));Olympus顯微鏡(日本);Opton熒光顯微鏡(德國(guó))。

1.1.3 動(dòng)物 SD大鼠，♀性，6月齡，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼料亦由該中心提供;各組大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件:光照12 h，黑暗12 h，室溫20～24℃，相對(duì)濕度40% ～70%，自由飲水、攝食。

1.2 方法

將大鼠麻醉后無(wú)菌條件下切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組只將卵巢和輸卵管牽引體外，然后再將其返回原處即可，不切除卵巢［3］。術(shù)后1周，將手術(shù)成功的大鼠按體重分為分為去卵巢模型組、淡豆豉提取物低劑量組(5 g生藥/kg·d)、淡豆豉提取物中劑量組(10 g生藥/kg·d)、淡豆豉提取物高劑量組(20 g生藥/kg·d)及陽(yáng)性藥仙靈骨葆組(0.5 g/kg·d)，每組8只。各組大鼠每天上午灌胃給藥，給藥容量為10 mL/kg，假手術(shù)組及去卵巢模型組大鼠給予等容量蒸餾水，連續(xù)12周。各組動(dòng)物于處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30 mg/kg體重，以對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。末次給藥后，處死大鼠，取左側(cè)脛骨近端1/3，將脛骨切成5 μm的縱向不脫鈣骨切片，置于熒光顯微鏡下觀察或甲苯胺藍(lán)染色后觀察，采用Leica Qwin圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量［4］。各參數(shù)如下:①骨小梁組織形態(tài)計(jì)量:骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、活性生成表面百分比(AFS%)、骨小梁礦化率(MAR)、骨小梁骨生成率(BFR)。② 皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計(jì)量:類(lèi)骨質(zhì)平均寬度(OSW)、骨皮質(zhì)礦化率(mAR)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨量參數(shù)TBV%和骨吸收參數(shù)TRS%的影響

去卵巢模型組大鼠骨量參數(shù)TBV%較假手術(shù)組大鼠明顯降低(P＜0.01)，骨吸收參數(shù)TRS%較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P＜0.01);淡豆豉提取物各劑量組大鼠TBV%較去卵巢模型組大鼠明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，TRS%明顯降低(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 淡豆豉提取物對(duì)去卵巢大鼠脛骨TBV%和TRS%的影響(ˉx±s)

2.2 對(duì)去卵巢大鼠脛骨形成參數(shù)TFS%、AFS%、MAR和BFR的影響

去卵巢模型組大鼠TFS%、AFS%、MAR和BFR均較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P＜0.01);淡豆豉提取物(20 g生藥/kg)組大鼠TFS%、AFS%較去卵巢模型組大鼠明顯降低(P＜0.05);各劑量的淡豆豉提取物均可不同程度地降低大鼠MAR、BFR水平(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 淡豆豉提取物對(duì)去卵巢大鼠脛骨TFS%、AFS%、MAR和BFR的影響(±s，n=8)

表2 淡豆豉提取物對(duì)去卵巢大鼠脛骨TFS%、AFS%、MAR和BFR的影響(±s，n=8)

注:與去卵巢模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑 量(g生藥/kg) TFS/% AFS/% MAR/(μm/d) BFR/(μm/d)假手術(shù)組 — 8.72±1.94** 8.94±2.07** 0.94±0.14** 7.65±2.31**去卵巢模型組 — 14.46±4.05 15.56±4.66 3.26±1.38 41.42±6.46淡豆豉提取物組 5 12.38±3.35 14.34±2.58 1.76±0.62* 20.27±5.14**10 10.82±2.86 14.96±2.82 1.58±0.22** 20.56±4.41**20 10.36±1.96* 11.06±2.86* 2.01±0.34* 22.16±4.55**仙靈骨葆組 0.5 10.71±2.05* 10.45±2.63* 1.56±0.25** 16.37±3.27**

2.3 對(duì)去卵巢大鼠脛骨OSW、mAR的影響

去卵巢模型組大鼠OSW、mAR較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P＜0.01);去卵巢模型組比較，淡豆豉提取物(20 g生藥/kg)組OSW明顯降低(P＜0.01)，淡豆豉提取物(10 g生藥/kg、20 g生藥/kg)組mAR明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

3 討論

中醫(yī)并無(wú)骨質(zhì)疏松病名，但“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”、“骨極”的描述與骨質(zhì)疏松極為相似。中醫(yī)認(rèn)為:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強(qiáng)?！惫堑纳L(zhǎng)發(fā)育與腎精盛衰關(guān)系密切，腎精充足則骨髓生化有源、骨骼得以滋養(yǎng)而強(qiáng)健有力;腎精虧虛則骨髓生化無(wú)源、骨骼失養(yǎng)而痿弱無(wú)力。婦女絕經(jīng)后，腎氣漸衰，腎精虛少，骨髓化源不足，不能營(yíng)養(yǎng)骨骼，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼脆弱無(wú)力，出現(xiàn)腰脊酸軟疼痛，下肢乏力，遇外力易發(fā)生骨折等骨質(zhì)疏松癥狀，可見(jiàn)，中醫(yī)的腎虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)［5］。

表3 淡豆豉提取物對(duì)去卵巢大鼠脛骨OSW、mAR的影響(±s)

表3 淡豆豉提取物對(duì)去卵巢大鼠脛骨OSW、mAR的影響(±s)

注:與去卵巢模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑 量/(g生藥/kg) 動(dòng)物數(shù)/只 OSW/μm mAR/(μm/d)假手術(shù)組 — 8 7.76±1.68** 2.01±0.81**去卵巢模型組 — 8 12.38±2.67 3.26±0.64淡豆豉提取物組 5 8 10.16±1.36 2.64±0.55 10 8 10.84±2.14 2.51±0.61*20 8 8.35±2.01** 2.56±0.34*仙靈骨葆組 0.5 8 9.74±1.43* 2.46±0.46*

現(xiàn)代研究認(rèn)為，絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)主要是由于雌激素水平下降，破骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨吸收增加，骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，以致骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性骨病。骨強(qiáng)度既與骨量有關(guān)，又與骨的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)。在骨質(zhì)疏松發(fā)生過(guò)程中，骨結(jié)構(gòu)的變化首先表現(xiàn)為骨小梁變細(xì)，隨著病程的發(fā)展，骨小梁穿孔、斷裂，最終導(dǎo)致骨小梁數(shù)量減少，連接減少，游離端增多骨的微觀結(jié)構(gòu)退化甚至破壞，這是骨的生物力學(xué)性能減退，容易發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因。Hahn等［6］認(rèn)為，骨量并不能完全反映松質(zhì)骨的穩(wěn)定性和力學(xué)強(qiáng)度，骨結(jié)構(gòu)的減退對(duì)骨的整體性能往往更具危害性。增加骨小梁數(shù)目、保護(hù)骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)是治療骨質(zhì)疏松的重要目的之一。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)是對(duì)骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析的重要手段。它能從組織學(xué)上，對(duì)骨的成分進(jìn)行分析，可以提供成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的活性、骨量的改變以及骨轉(zhuǎn)換率、骨結(jié)構(gòu)的形態(tài)與數(shù)值信息，判斷骨重建的狀況。通過(guò)進(jìn)行四環(huán)素?zé)晒馕镔|(zhì)標(biāo)記，還可以對(duì)骨礦代謝和骨形成過(guò)程進(jìn)行定量分析。

去卵巢模型現(xiàn)已成為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的經(jīng)典動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:大鼠切除卵巢3個(gè)月后，作為骨量主要標(biāo)志的脛骨TBV%顯著降低，而代表骨吸收參數(shù)的TRS%以及代表骨形成參數(shù)的TFS%、AFS%、MAR、BFR、OSW 和 mAR 皆顯著增高，成功地模擬了絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型，這一結(jié)果與大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相一致［7］。給去卵巢大鼠灌服淡豆豉提取物12周后能使上述指標(biāo)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，骨的空間微細(xì)結(jié)構(gòu)得以改善，對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松有一定的防治作用。淡豆豉的生物活性成分主要為大豆異黃酮，大豆異黃酮的生物活性主要體現(xiàn)在4種主要單體組分上，即染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元，大豆異黃酮在結(jié)構(gòu)和功能上與雌激素有相似之處，因此被認(rèn)為是植物雌激素。當(dāng)人體內(nèi)雌激素水平低時(shí)，植物異黃酮占據(jù)雌激素受體，發(fā)揮弱雌激素效應(yīng)［8］，也有研究提示大豆苷元比大豆苷能更有效地預(yù)防去卵巢大鼠骨丟失［9］，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)大豆經(jīng)炮制后大豆苷元含量明顯增加［10］，由此推測(cè)淡豆豉可能比大豆具有更強(qiáng)的抗骨質(zhì)疏松作用，進(jìn)一步的研究仍在進(jìn)行中。

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