萎胃寧濃縮丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄧 沂， 魏舒暢， 李 蕓*， 苗小樓， 金 輝

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050;3.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽蕪湖241000)

萎胃寧濃縮丸由黃連、黃芩、芍藥、白芷、木香、甘草、山楂等十二味中藥組成。萎胃寧方出自中國百年百名中醫(yī)名家于己百教授，以半夏瀉心湯為主，旋覆代赭湯為輔組得萎胃寧方。該方經(jīng)過大量的臨床實(shí)驗(yàn)證明對(duì)慢性萎縮性胃炎具有良好的療效。前期工作已對(duì)萎胃寧蜜丸進(jìn)行劑型改造，制成濃縮丸。目前，該制劑的質(zhì)量控制尚無定性鑒別指標(biāo)，僅有在前期工作中初步建立的芍藥苷含量測(cè)定方法［1］，且沒有對(duì)方中的君藥進(jìn)行質(zhì)量控制。為了控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用TLC建立了方中君藥黃連、臣藥甘草、佐藥白芍、白芷和使藥山楂的鑒別方法，并采用HPLC法建立君藥黃連的含量測(cè)定方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)單、快速、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，600泵，2487雙波長(zhǎng)吸光度檢測(cè)器，Empower色譜工作站;電子天平(BP211 Sartorious);ZFTC三用紫外分析儀(上?？等A生化儀器有限公司);KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);超純水制備儀(成都唐氏康科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 對(duì)照品:鹽酸小檗堿(110713-200609，供含量測(cè)定用，含量 98.1%)、芍藥苷(110736-200629)、甘草苷(111610-200604)、歐前胡素(110826-200511，供鑒別用)、異歐前胡素(110827-200407，供鑒別用)、熊果酸(110742-200415，供鑒別用)和對(duì)照藥材:黃連(120913-200407)、甘草(120904-200511)、山楂(121138-200704)均購自中國藥品生物制品檢定所;試劑均為分析純，超純水自制。萎胃寧濃縮丸自制。各陰性樣品:按處方分別配成相應(yīng)的缺味處方藥，模擬制劑工藝制備。硅膠G，硅膠GF254薄層板(青島海洋化工廠)。

2 定性分析

2.1 黃連薄層色譜 分別取3批本品粉末1.0 g，加入20 mL甲醇回流15 min，過濾，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。取黃連對(duì)照藥材20 mg及陰性對(duì)照粉末同法制備對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液，另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6∶3 ∶1.5 ∶1.5 ∶0.5)為展開劑，置氨飽和的層析缸內(nèi)展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同的4個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的一個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，見圖1。

2.2 山楂薄層色譜［2］分別取3批本品粉末3.0 g，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至3 mL，作為供試品溶液。取陰性對(duì)照粉末同法制備陰性對(duì)照溶液，另取熊果酸對(duì)照品1 mg，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各3 μL，熊果酸對(duì)照品2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(32∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的一個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，見圖2。

圖1 黃連的TLC

圖2 山楂的TLC

2.3 白芷薄層色譜［2］分別取3批本品粉末5.0 g，加乙醚30 mL，回流30 min，放冷，過濾，回收乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照溶液。另取歐前胡素和異歐前胡素對(duì)照品，加乙酸乙酯分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-乙醚(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，分別置紫外光燈254 nm和365 nm下檢視.供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的淡藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，見圖3、4。

圖3 白芷的TLC(UV 254 nm)

圖4 白芷的TLC(UV 365 nm)

2.4 白芍、甘草的薄層鑒別［2-4］分別取3批本品粉末5.0 g，加乙醚50mL，回流1h，放冷，過濾，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚后加甲醇40 mL繼續(xù)回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次(每次20 mL)，合并正丁醇液，用水洗滌3次(每次20 mL)，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材1 g、甘草陰性對(duì)照樣品以及白芍陰性對(duì)照粉末同法制備甘草對(duì)照藥材溶液、甘草陰性及白芍陰性對(duì)照溶液，另取甘草苷、芍藥苷對(duì)照品，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述6種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(8∶1∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品與對(duì)照藥材、對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，見圖5。

圖5 甘草、白芍的TLC

3 定量分析

3.1 色譜條件 色譜柱:Theromo BDS Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0.1%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.1 g，含三乙胺0.2 mL)(40∶60)(pH 6.0);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm，進(jìn)樣量:20 μL，柱溫:30℃。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿對(duì)照品2.91 mg置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻即可。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1.0 g(過80目篩)，精密稱取，置于100 mL量瓶中，加1%鹽酸的甲醇溶液70 mL，超聲(250 W，50 kHz)提取40 min，放至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

3.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 取缺黃連的陰性對(duì)照樣品粉末，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，各進(jìn)樣20 μL，測(cè)得HPLC圖譜(見圖6)，tR=14.645，分離度R=2.50，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算不低于10 000。表明陰性樣品在與對(duì)照品色譜相同位置處無干擾。

圖6 對(duì)照品及樣品的HPLC色譜圖

3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品貯備液0.1、0.5、1、2、4、8 mL，分別置于 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，連同對(duì)照品貯備液共7份系列工作溶液，分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，鹽酸小檗堿在1.142 μg/mL～114.2 μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=8.28×107X－1.52×104，r=0.999 978(n=7)。

3.5 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液依法重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD=0.96%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在24 h內(nèi)每隔0.5 h、1 h 或不定的時(shí)間段(0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24 h)進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算鹽酸小檗堿的 RSD=2.24%，可見，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品各5份，按供試品溶液的制備方法制備溶液，按上述色譜條件測(cè)得鹽酸小檗堿的平均含量為1.349 4 mg/g，RSD=2.79%。

3.8 最低檢測(cè)限 精密吸取上述對(duì)照品溶液適量，加流動(dòng)相逐步稀釋至色譜圖中鹽酸小檗堿峰高為噪音的3倍(信噪比S/N≥3)。鹽酸小檗堿的最低檢測(cè)限為0.23 μg/mL。

3.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量(1.349 4 mg/g)的萎胃寧樣品各0.1 g，分別精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液(0.114 2 mg/mL)1 mL，照供試品溶液制備方法制備并依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.10 含量測(cè)定 精密稱取5批不同批號(hào)的萎胃寧樣品，按供試品溶液的制備方法制備溶液，測(cè)定含量，結(jié)果見表2

表2 含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 黃連為方中君藥，對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用TLC對(duì)其進(jìn)行定性鑒別、采用HPLC對(duì)其有效成分鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定，所建方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

4.2 山楂的鑒別曾調(diào)整展開系統(tǒng):苯-乙酸乙酯-甲酸比例(20∶4∶0.5)→(20∶6∶0.5)→(20∶10∶0.5)→(24∶4∶0.5)→(28∶4∶0.5)→(32∶4∶0.5)，以硅膠 G 薄層板展開，結(jié)果以后者效果最理想。

4.3 甘草、白芍的鑒別實(shí)驗(yàn)中，采用一種方法鑒別兩味中藥材，方法靈敏，陰性無干擾。

4.4 流動(dòng)相的選擇:在含量測(cè)定時(shí)，流動(dòng)相分別采用:A乙腈-磷酸系統(tǒng);B 乙腈-磷酸二氫鈉溶液系統(tǒng)［5-9］;C 乙腈-磷酸-硫酸鈉系統(tǒng)［2，10］;D 乙腈-磷酸-硫酸鈉-三乙胺系統(tǒng)［11-12］。采用A、B系統(tǒng)，樣品根本不能分離，形成一個(gè)或兩個(gè)肩峰或饅頭峰?？紤]到鹽酸小檗堿為季銨鹽這一特殊性質(zhì)，在一般的固定相中不保留，為此考慮在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑十二烷基磺酸鈉(SDS)(即C系統(tǒng))，延長(zhǎng)了被測(cè)組份在固定相中的保留時(shí)間，且色譜圖由一個(gè)或二個(gè)饅頭峰變?yōu)樵S多尖銳峰，基本上能看到被測(cè)組分的峰，但被測(cè)組分嚴(yán)重拖尾，并且達(dá)不到基線分離。通過分析流動(dòng)相的pH值，試向流動(dòng)相中加入了三乙胺(即D系統(tǒng))，結(jié)果分離效果很理想(見圖6B)，達(dá)到了基線分離，峰型對(duì)稱，不再拖尾，分離度為2.5，理論板數(shù)達(dá)到了160 00。

4.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:檢測(cè)波長(zhǎng)曾選擇265 nm，270 nm，345 nm，350 nm，結(jié)果以350nm干擾峰最少，分離最好，效果最佳。

4.6 提取溶劑及時(shí)間的選擇:參照相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，對(duì)提取溶劑進(jìn)行了篩選。分別用甲醇、1%鹽酸的甲醇溶液進(jìn)行超聲提取，考察不同溶劑對(duì)鹽酸小檗堿含量的影響。結(jié)果采用1%鹽酸的甲醇溶液提取時(shí)，鹽酸小檗堿的含量比用甲醇提取的高。因此本試驗(yàn)選用1%鹽酸的甲醇溶液作為該制劑的提取溶劑;另外，通過試驗(yàn)摸索，比較不同超聲處理時(shí)間20、30、40、50、60 min 對(duì)提取效果的影響，結(jié)果在 40 ～60 min內(nèi)含量變化已不大，說明鹽酸小檗堿基本提盡，故選40 min為提取時(shí)間。

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