青陽參總皂苷的微波法提取工藝研究

周進(jìn)康， 何 軍， 梁志遠(yuǎn)， 冉曉燕

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550018)

青陽參(Cynanchum otophyllum Scheid)為蘿摩科鵝絨藤屬植物，又名青羊參、白石參、斷節(jié)參等。主要分布于云南、貴州等西南山區(qū)。青陽參有效成分是從其根部提取的甾體皂苷類物質(zhì)，有益腎強(qiáng)筋、豁痰鎮(zhèn)痙、定癇之功效，用于治療癲癇、腰骨痛、頭昏頭痛等癥［1，2］。青陽參總皂苷(total saponins)的藥理作用［3，4］、化學(xué)成分［5-6］等的研究得到人們關(guān)注。但是，關(guān)于青陽參皂苷提取方法研究報(bào)道少見。我們以青陽參皂苷提取率為指標(biāo)，采用微波法提取，對(duì)微波提取工藝進(jìn)行了考察，并與回流法、索氏提取法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微波法簡便易行，效率較高。

1 材料

1.1 儀器

722S可見光分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，XH-100A微波催化合成/萃取儀(北京祥鴿科技有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);Sarforius電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試劑

青陽參藥材(云南千草源藥業(yè)有限公司)，青陽參皂苷對(duì)照品(批號(hào):20070460，純度99.9%，云南白藥集團(tuán)天然藥物研究院)，甲醇、無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛等均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 青陽參皂苷對(duì)照品溶液的制備 精密稱取青陽參皂苷對(duì)照品19.6 mg，置500 mL量瓶中。用甲醇定容至刻度，搖勻，即為0.039 2 mg/mL的青陽參皂苷對(duì)照液。

2.1.2 青陽參皂苷供試液的制備 精密吸取各種提取工藝得到的提取液1 mL至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度即為供試液。

2.2 青陽參總皂苷比色方法的建立

2.2.1 青陽參皂苷的顯色 精密吸取對(duì)照液(或供試液)于試管中蒸干。加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液-高氯酸(1∶4)1 mL，在60℃水浴中加熱15 min后取出，冰水浴冷卻后加5 mL甲醇，搖勻待測。

2.2.2 測定波長的確定 取對(duì)照液2 mL，用上述方法顯色，另取5%香草醛冰醋酸溶液-高氯酸(1︰4)1 mL，在60℃水浴中加熱15 min，冰水浴冷卻后加5 mL甲醇，搖勻?yàn)榭瞻讓?duì)照，在300～650 nm波長處掃描，結(jié)果顯示，最大吸收波長選578 nm較合適。取供試液，同法操作，顯示最大吸收波長為578 nm，見圖1。

圖1 青陽參提取液光譜圖

結(jié)果表明對(duì)照液和供試液合適的最大吸收波長一致，選定578 nm作為測定波長。

2.2.3 顯色穩(wěn)定性考察 取2 mL對(duì)照液和供試液分別于試管中蒸干，用上述方法顯色，按2.2.2項(xiàng)測試方法在578 nm處測定吸光度值(測定完立即放入冰水中)，每小時(shí)測定一次，測5次。結(jié)果578 nm處吸光度值的RSD分別為1.2%和1.4%，表明樣品在冰水中放置穩(wěn)定性較好。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取青陽參皂苷對(duì)照液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，揮去溶劑，用上述顯色和測試方法于波長578 nm處測定吸光度A。以對(duì)照液皂苷濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程:A=6.172 7C+0.030 6，r=0.999 9，n=5。線性范圍:0.039 2～0.196 0 mg/mL。

2.2.5 樣品的測定 精密吸取供試液2 mL，用上述顯色和測試方法，于578 nm處測定吸光度A。由回歸方程得皂苷濃度C，由下式計(jì)算青陽參總皂苷的提取率(W為青陽參生藥干粉的質(zhì)量)。

2.3 提取工藝

2.3.1 醇濃度的考察 精密稱取約5 g青陽參生藥干粉6份，置于100 mL燒瓶中，分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液50 mL，微波輻射(80 W)處理15 min。取出冷卻即得提取液，加溶劑重復(fù)提取1次，合并提取液，過濾，濃縮并定容至100 mL，按2.1.2項(xiàng)配成得供試液，用上述顯色和測試方法，測定其吸光度，計(jì)算青陽參總皂苷的濃度和提取率，每個(gè)樣品平行兩份，結(jié)果取均值。發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)提取率達(dá)到穩(wěn)定，結(jié)果見表1。

表1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.3.2 投料比的確定 精密稱取約5 g青陽參生藥干粉5份，置于 100 mL 燒瓶中，分別加入 25、40、50、60、75 mL 60%乙醇水溶液，微波(80 W)輻射15 min。取出冰水冷卻后，得提取液，加溶劑重復(fù)提取1次，合并提液，過濾，濃縮并定容至100 mL，按2.1.2項(xiàng)配成得供試液。用上述顯色和測試方法，測定其吸光度，計(jì)算青陽參總皂苷的濃度和提取率，每個(gè)樣品平行兩份，結(jié)果取均值。從結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比增至1∶10時(shí)提取率基本穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 投料比對(duì)提取率的影響

2.3.3 微波條件的選擇 精密稱取約5 g青陽參生藥干粉9份，于100 mL燒瓶中，正交試驗(yàn)優(yōu)化青陽參皂苷的提取工藝條件，即以提取微波功率、溫度、時(shí)間、提取次數(shù)作研究對(duì)象，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表3。合并提取液，過濾，濃縮，定容至100 mL得提取液，按2.1.2項(xiàng)配成得供試液，用上述顯色和測試方法，測定其吸光度，計(jì)算青陽參總皂苷的濃度和提取率，結(jié)果見表4。

表3 因素水平表

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 工藝驗(yàn)證 取約5 g青陽參生藥干粉4份，按工藝參數(shù)A2B3C2D2提取，合并兩次提取的提取液，過濾，濃縮，定容至100 mL，按2.1.2項(xiàng)配成得供試液，用上述顯色和測試方法，測定其吸光度，計(jì)算青陽參總皂苷的濃度和提取率。青陽參皂苷的提取率平均達(dá)到3.21%以上，結(jié)果見表5。

2.3.5 微波法與回流、索氏提取法的比較 按上述正交實(shí)驗(yàn)確定的微波法提取工藝，在溶劑乙醇濃度、料液比等條件相同的條件下，進(jìn)行微波、回流、索氏法提取，分別進(jìn)行4次平行試驗(yàn)，提取參數(shù)和提取率差異見表6。

3 討論

3.1 由正交實(shí)驗(yàn)(表3、4)進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，各因素的影響力由大到小依次是:微波功率、溫度、次數(shù)、時(shí)間，即A2>B3>D2>C3。由于15 min和20 min對(duì)提取率影響無太大差異，考慮到節(jié)約時(shí)間和能源，可選用15 min進(jìn)行提取，因此最佳的提取工藝組合為:A2B3C2D2。結(jié)合表1、2的結(jié)果，即確定工藝條件為功率80 W、溫度60℃、時(shí)間15 min、次數(shù)2、乙醇濃度60%、液料比1∶10。

表5 工藝驗(yàn)證結(jié)果

表6 微波和回流、索氏方法的比較

3.2 微波法用于青陽參總皂苷的提取，工藝驗(yàn)證結(jié)果較好，提取重復(fù)性高(表5)。應(yīng)用微波技術(shù)［7］:物料吸收微波后，通過偶極子旋轉(zhuǎn)和離子傳導(dǎo)兩種方式由內(nèi)外同時(shí)加熱，溫度升高較快。同時(shí)，從表6結(jié)果可看出，微波法和回流法、索氏提取法相比，提取率變化不大，卻可有效降低提取所需的溫度和時(shí)間，降低了能耗，能快速且方便地進(jìn)行青陽參皂苷的提取。但由于微波儀器容積的限制，目前僅用于科學(xué)研究和含量的測定。

3.3 青陽參的主要活性成分為甾體皂苷類物質(zhì)。隨著青陽參藥理作用的研究和認(rèn)識(shí)［2-4］，青陽參將會(huì)得到進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用，它的提取工藝也將被人們所關(guān)注。

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