復(fù)方雞血藤膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳 融， 盧 燕， 陳道峰

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海201203)

復(fù)方雞血藤膏為一傳統(tǒng)的婦科良藥，始創(chuàng)于清道光年間，現(xiàn)收載于《中國藥典》(2005年版一部)，由滇雞血藤膏粉(218.75 g)、川牛膝(59.5 g)、續(xù)斷(53 g)、紅花(5 g)和黑豆(12.5 g)配伍，以糯米(437.5 g)、飴糖(300 g)為輔料制成，功能補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)，用于血虛、手足麻木、關(guān)節(jié)酸痛和月經(jīng)不調(diào)等癥。由于基礎(chǔ)研究薄弱，現(xiàn)行藥典中復(fù)方雞血藤膏項(xiàng)下僅規(guī)定了制劑性狀及專屬性很差的香豆素類、酚類化合物的顯色反應(yīng)，缺乏方中各味藥的特征性鑒別和指標(biāo)成分的含量測定［1］。方中君藥滇雞血藤膏粉為滇雞血藤(木蘭科內(nèi)南五味子Kadsura interior A.C.Smith的藤莖)的水提干浸膏粉，處方劑量約為其他四味藥原藥材總量的2倍，是復(fù)方雞血藤膏質(zhì)量控制研究的重點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素是滇雞血藤的主要活性成分，其中異型南五味子丁素(heteroclitin D)含量高、活性強(qiáng)，具有抗氧化、鈣拮抗、抑制血小板聚集等與藥材傳統(tǒng)功效一致的藥理作用，可作為滇雞血藤及其復(fù)方制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分［2-5］。為了有效鑒別和質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)建立了制劑中滇雞血藤、川牛膝和續(xù)斷三味主藥的特征性TLC鑒別方法，并采用HPLC方法建立了異型南五味子丁素的含量測定方法，為完善復(fù)方雞血藤膏這一傳統(tǒng)中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent HP1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器;SHANGPING FA1004天平(上海天平儀器廠);ZX-91旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)所);電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海華連醫(yī)療器械有限公司);DL-360超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);硅膠GF254、硅膠G薄層板(煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠試驗(yàn)廠);HPLC測定用甲醇、乙腈為色譜純，水為市售純凈水;其他試劑均為分析純。

對照品異型南五味子丁素(丁素)為自制，經(jīng)IR、MS、1HNMR、13CNMR 確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，純度經(jīng)HPLC-ELSD法測定大于98%;川牛膝對照藥材(1065-200002)、續(xù)斷對照藥材(121033-200306)購于中國藥品生物制品檢定所;8批復(fù)方雞血藤膏樣品 (20031201，20050601，20050801，20060919，20061101，20070106，20070701，20080301)和滇雞血藤對照藥材由云南廣福藥業(yè)有限公司提供，對照藥材經(jīng)鑒定為內(nèi)南五味子K.interior A.C.Smith的藤莖。

TLC鑒別用陰性對照樣品照《中國藥典》(2005年版一部)規(guī)定的復(fù)方雞血藤膏相同工藝按處方量1/20取樣自制;其中滇雞血藤膏粉為內(nèi)南五味子K.interior的干燥藤莖經(jīng)加工制成的浸膏粉，由云南廣福藥業(yè)有限公司提供;川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis kuan的干燥根，續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根，紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，黑豆為豆科植物大豆Clycine max(L.)Merr.的干燥的黑色種子，該四味藥材均購自上海華宇藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC定性鑒別

2.1.1 滇雞血藤的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加熱水50 mL溶解，放冷，取上清液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次50 mL，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺滇雞血藤的復(fù)方雞血藤膏陰性對照樣品5 g，同法制成陰性對照溶液。另取滇雞血藤對照藥材2 g，加熱水50 mL，同法制成對照藥材溶液。再取異型南五味子丁素對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(2 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照色譜無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 滇雞血藤的TLC鑒別圖譜

2.1.2 川牛膝的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水10 mL溶解，用乙醚振搖提取2次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺川牛膝的復(fù)方雞血藤膏陰性對照樣品5 g，同法制成陰性對照溶液。另取川牛膝對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照色譜無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 川牛膝的TLC鑒別圖譜

2.1.3 續(xù)斷的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺續(xù)斷的復(fù)方雞血藤膏陰性對照樣品5 g，同法制成陰性對照溶液。另取續(xù)斷對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，加熱至顯色明顯。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的淡紫紅色斑點(diǎn)，陰性對照色譜無干擾。結(jié)果見圖3。

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:YMC ODS-H80 4 μm(250 mm×4.6 mm ID);預(yù)柱:Phenomenex C18(4 mm L×3.0 mm ID);流動相為甲醇-乙腈-水(10 ∶48∶42);流速:1 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:230 nm。在此色譜條件下，異型南五味子丁素峰與前后峰分離度大于1.5，理論板數(shù)大于10 000，溶劑峰、陰性對照均無干擾，結(jié)果見圖4。

圖3 續(xù)斷的TLC鑒別圖譜

圖4 復(fù)方雞血藤膏HPLC色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系考察 取異型南五味子丁素對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.144 mg的溶液，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液5、7、10、20、50、100、200 μL，分別加甲醇稀釋定容至 1 mL，作為對照品稀釋液。精密吸取上述稀釋液各20 μL，進(jìn)樣，以峰面積 A對進(jìn)樣濃度 C(μg/mL)求得線性回歸方程。結(jié)果表明丁素在0.72 μg/mL～28.8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為 A=6.64×104C－0.104，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.2.3 供試品及陰性對照溶液的制備 取本品研細(xì)，過五號篩，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入環(huán)己烷50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理50 min，放冷，再稱定重量，用環(huán)己烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密稱取缺滇雞血藤的復(fù)方雞血藤膏陰性對照樣品粉末0.5 g，同法制成陰性對照溶液。

2.2.4 檢測限和定量限考察 采用信噪比法，進(jìn)空白溶劑后，測出噪音，進(jìn)已知濃度的對照品，根據(jù)其對應(yīng)的峰高值，將對照品溶液稀釋至約3、10倍信噪比高度的濃度，即為檢測限與定量限。所得檢測限為7.2×10－8g/mL;定量限為2.74×10－7g/mL(n=6，RSD值為2.7%)。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份對照品溶液(對照品貯備液稀釋50倍)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，異型南五味子丁素峰面積的RSD值為2.2%;取批號為20070106的樣品粉末(過五號篩)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，丁素峰面積RSD值為1.0%，表明方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.5項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 及1、2、3、4、5、6 d 進(jìn)樣，每次20 μL，計(jì)算異型南五味子丁素含量，結(jié)果顯示同一天12 h內(nèi)丁素含量的RSD值為1.2%，6 d內(nèi)RSD值為2.0%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為20070106的樣品粉末(過五號篩)，按2.2.3項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，測定異型南五味子丁素的含量，平均含量為33.2 μg/g，RSD值為2.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.144 mg/mL的對照品溶液60 μL，加至具塞錐形瓶中，共6份;于水浴上蒸干后，取批號為20070106的樣品粉末(過五號篩)6份，每份約0.25 g，精密稱定，加入上述具塞錐形瓶中，按2.2.3項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定異型南五味子丁素的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。平均加樣回收率為101.9%，RSD值為2.8%。

2.2.9 耐用性考察 采用3根不同廠家的色譜柱按2.2.1項(xiàng)下色譜條件對同一供試品溶液進(jìn)行分離，并計(jì)算異型南五味子丁素的含量，結(jié)果見表2。3根色譜柱的測定結(jié)果無明顯差異，RSD值為0.29%，表明方法耐用性良好。

表1 復(fù)方雞血藤膏中異型南五味子丁素含量測定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 不同型號色譜柱的耐用性試驗(yàn)

2.2.10 異型南五味子丁素的含量測定 精密吸取對照品貯備液5 μL、50 μL，分別用甲醇稀釋定容至1 mL，作為隨行對照品溶液。取各批次復(fù)方雞血藤膏樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法，制備供試品溶液。分別精密吸取隨行對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定異型南五味子丁素的含量，并按干燥品計(jì)算樣品的異型南五味子丁素含量(結(jié)果見表3)。

表3 復(fù)方雞血藤膏中異型南五味子丁素的含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 除內(nèi)南五味子外，同屬植物異型南五味子K.heteroclita(Roxb.)Craib和五味子屬植物鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Bail var.intermedia A.C.Smith的藤莖在民間均作為熬制“滇雞血藤膏”的原料［6］，但以內(nèi)南五味子品質(zhì)好、產(chǎn)量大。為了保證質(zhì)量的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)建立的滇雞血藤TLC鑒別方法同時以活性成分異型南五味子丁素和內(nèi)南五味子藤莖為對照，特征明顯、專屬性強(qiáng)。由于川牛膝、續(xù)斷活性成分不明確，這兩味藥的TLC鑒別僅采用對照藥材為對照。經(jīng)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)所建立的三味主藥的TLC鑒別方法對于溫度、濕度和不同廠家薄層板均有良好的耐用性。

3.2 滇雞血藤中活性木脂素類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，水溶性較低，木脂素類成分HPLC分析常用的甲醇-水或乙腈-水很難在短時間內(nèi)將異型南五味子丁素與其他成分完全分離，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)多次條件優(yōu)化確定了甲醇-乙腈-水(10 ∶48 ∶42)的流動相組成，丁素峰的分離度大于1.5，保留時間25 min左右，并根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］的研究結(jié)果，采用環(huán)己烷為提取溶劑，通過對提取方法、提取時間和溶劑用量的考察，最終確定了供試品溶液的制備方法。

3.3 對8批復(fù)方雞血藤膏樣品進(jìn)行了干燥失重檢查，各批樣品的減失重量為7.73% ～11.76%，符合《中國藥典》2005年版復(fù)方雞血藤膏項(xiàng)下規(guī)定。為了增加數(shù)據(jù)的可比性，以干燥品計(jì)算了各批樣品中的異性南五味子丁素含量，結(jié)果見表3。

3.4 HPLC含量測定結(jié)果顯示，8批復(fù)方雞血藤膏中丁素含量差異較大，說明采用現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)中簡單的性狀和化學(xué)反應(yīng)定性鑒別難以控制質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定性。滇雞血藤膏粉傳統(tǒng)的水提制備工藝對丁素等木脂素類有效成分的提取率較低(采用本實(shí)驗(yàn)的HPLC方法測定，丁素含量僅為0.001 7%-0.028%)，加上輔料糯米和飴糖的大量應(yīng)用(總膏量的70%以上)，造成復(fù)方雞血藤膏中丁素含量很低，本實(shí)驗(yàn)所測的8批樣品中含量最高的以干燥品計(jì)也不到0.005 0%。另外，復(fù)方雞血藤膏劑型落后，需用水、酒各半燉化服用，非常不方便。因此，需要對復(fù)方雞血藤膏進(jìn)行制備工藝和劑型改良，以利于提高原料利用率、減小用量和便于服用，更好地發(fā)揮這一古老制劑的獨(dú)特療效。

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