禽源大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)*

張維秋,潘渭涓,陳 祥,耿士忠,黃金林,潘志明,焦新安

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

禽源大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)*

張維秋,潘渭涓,陳 祥,耿士忠,黃金林,潘志明,焦新安*

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

從我國(guó)部分地區(qū)病、死家禽中分離到大腸埃希菌403株。按照CLSI(clinical and laboratory standards institute)推薦的K-B藥敏紙片法對(duì)其中的344株分離株進(jìn)行藥敏紙片試驗(yàn);根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列,設(shè)計(jì)并合成了五對(duì)引物,對(duì)所有分離細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因的擴(kuò)增:qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib-cr和qepA。1993年-1996年禽源大腸埃希菌分離株僅對(duì)萘啶酸的耐藥率超過(guò)60%;2001年-2008年禽源大腸埃希菌分離株對(duì)1-3代7種喹諾酮類藥物的耐藥率均超過(guò)58%。在403株禽源大腸埃希菌中共檢出3(0.7%)株qnrB陽(yáng)性菌株,2(0.5%)株qnrS陽(yáng)性菌株,5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性菌株以及5(1.2%)株qepA陽(yáng)性菌株,未檢測(cè)到qnrA陽(yáng)性菌株。結(jié)果顯示,近20年來(lái),我國(guó)禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性不斷上升,同時(shí),質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因在禽源大腸埃希菌中呈不斷上升的流行趨勢(shì)。

禽;大腸埃希菌;喹諾酮耐藥性;質(zhì)粒介導(dǎo)

長(zhǎng)期以來(lái),以治療、預(yù)防疾病和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)為目的,不合理使用抗生素,導(dǎo)致抗生素過(guò)度使用或?yàn)E用,在抗生素的選擇性壓力下,大腸埃希菌耐藥性不斷上升,這已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。喹諾酮類藥物在臨床上是我國(guó)治療禽大腸埃希菌病的常規(guī)用藥之一,而對(duì)喹諾酮類藥物的不合理使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的增加以及耐藥譜的變化,細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制過(guò)去普遍認(rèn)為主要為染色體基因突變,而不存在水平傳播的可轉(zhuǎn)移基因。近年來(lái)開始出現(xiàn)一些新的喹諾酮類藥物耐藥基因位于細(xì)菌質(zhì)粒上,使得喹諾酮類藥物耐藥性在人獸共患病原菌間的迅速擴(kuò)散成為可能,嚴(yán)重威脅人類健康。

1998年,Martinez-M artinez L等[2]發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因 qnr(現(xiàn)命名為qnrA),其編碼蛋白與Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶特異性結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。近年來(lái),qnrB[3],qnrS[4],aac(6′)-Ib-cr[5],qepA[6]等新型質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因陸續(xù)被報(bào)道證實(shí)。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制補(bǔ)充了傳統(tǒng)的細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥途徑,使得耐藥的形式多樣化。

本研究通過(guò)藥敏紙片法分析我國(guó)禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性變化,同時(shí)通過(guò)PCR檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥(PMQR)基因,了解PMQR在禽源大腸埃希菌中的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源和培養(yǎng)條件 1993年-2009年從江蘇、上海等18個(gè)省、市、自治區(qū)收集具有大腸埃希菌病變的禽肝臟、脾臟、卵巢等作病料。大腸埃希菌病料直接劃線接種于麥康凱平板,37℃培養(yǎng)18 h,挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng)18 h后挑取單個(gè)典型菌落純培養(yǎng)后凍干保存,共分離并保存403株禽源大腸埃希菌。qnrA,qnrB,qnrS陽(yáng)性菌株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院蔣琰博士惠贈(zèng);qepA陽(yáng)性質(zhì)粒由日本國(guó)家傳染病控制中心Yamane K教授惠贈(zèng);aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。質(zhì)控菌:大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923由本室保存。

1.1.2 主要試劑 8種抗生素藥敏紙片:萘啶酸(Nalicixic acid,NA),依諾沙星(Enoxacin,ENX),諾氟沙星(Norfloxacin,NOR),氧氟沙星(Ofloxacin,OFL),氟諾沙星(Fleroxacin,FLX),環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP),洛美沙星(Lomefloxacin,LM L),加替沙星(Gatifloxacin,GAT),均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;麥康凱干粉培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂(MH)等試劑為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;DNA marker,DNA polym erase,FokⅠ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;dNTP購(gòu)自Promega公司;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2 藥敏紙片試驗(yàn)

按CLSI推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行[7],對(duì)1993年-2008年分離的344株大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),參照CLSI手冊(cè)中藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)作出結(jié)果判斷。

1.3 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥(PMQR)基因的檢測(cè)

1.3.1 PMQR基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)及Gen-Bank中已發(fā)表的序列,分別設(shè)計(jì)出針對(duì) qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib 和 qepA 的 5對(duì)特異性引物(引物序列見表1),對(duì)403株大腸埃希菌分離株進(jìn)行檢測(cè)。

表1 PCR引物序列Tab le 1 The sequences of prim ers for PCR

1.3.2 PCR擴(kuò)增 細(xì)菌DNA模板的制備按全菌裂解法進(jìn)行[10],qnr的PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性3m in,94℃變性30 S,57℃退火30 S,72℃延伸40 S,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min,4℃保存,aac(6′)-ib和qepA的退火溫度為60℃。對(duì)于aac(6′)-ib基因陽(yáng)性的菌株,PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)FokⅠ酶切鑒定,變異體不存在此酶切位點(diǎn),而野生型能被酶切。所有陽(yáng)性菌株P(guān)CR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 禽源大腸埃希菌藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果

在8種喹諾酮類藥物中,大腸埃希菌對(duì)第一代喹諾酮類藥物萘啶酸的耐藥率最高(76.5%),對(duì)第四代喹諾酮類藥物耐藥率最低(19.8%)。耐藥率低于50%的有諾氟沙星(40.4%)、氧氟沙星(38.7%)、環(huán)丙沙星(44.8%)(表 2)。1993 年-1996年大腸埃希菌分離株耐藥率超過(guò)60%的僅有萘啶酸(61.6%),對(duì)其余7種藥物耐藥率均低于50%,其中有三種藥物的耐藥率低于20%,分別為諾氟沙星(19.2%)、氧氟沙星(18.1%)、加替沙星(10.7%)。1997年-2000年大腸埃希菌分離株對(duì)氟諾沙星(63.3%)和洛美沙星(60.0%)2種抗生素的耐藥率超過(guò)60%;2001年-2004年大腸埃希菌分離株對(duì)除加替沙星外的7種抗生素耐藥均超過(guò)66.7%,對(duì)萘啶酸的耐藥率達(dá)到97.7%。2005年-2008年間的大腸埃希菌雖然對(duì)前三代喹諾酮的耐藥率相較2001年-2004年稍有下降,但是仍然保持一個(gè)很高的耐藥率(表2)。

表2 禽源大腸埃希菌藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of antimicrobial sensitivity test of avian E.coli isolatesby usingthe Kirby-Bauer method

2.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

在403株禽源大腸埃希菌中共檢測(cè)到qnrB陽(yáng)性菌株3株,qnrS陽(yáng)性菌株2株,aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性菌株5株,qepA陽(yáng)性菌株5株,分別占菌株總數(shù)的0.7%,0.5%,1.5%,1.5%。陽(yáng)性對(duì)照株擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1,PMQR基因陽(yáng)性菌株背景材料見表3。

圖1 陽(yáng)性對(duì)照株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR products of positive strains

表3 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因陽(yáng)性菌株的背景資料Table 3 Characteristics of plasm id-mediated quinolone resistance strains

2.3 DNA測(cè)序結(jié)果

根據(jù)National Center for Biotechnology In formation(NCBI)中的BLASTn檢索結(jié)果顯示,陽(yáng)性菌株所攜帶的喹諾酮類質(zhì)粒耐藥基因序列與網(wǎng)上公布的序列一致。

3 討論

近年來(lái),隨著喹諾酮類藥物的大量使用甚至濫用,大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥率不斷上升。本研究結(jié)果顯示,從上世紀(jì)90年代起禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類部分抗生素耐藥性已經(jīng)較強(qiáng),近十幾年來(lái)大腸埃希菌分離株對(duì)大部分氟喹諾酮類抗生素耐藥性提高了兩倍以上。值得注意的是2005年-2008年分離株相較2001年-2004年雖然對(duì)1到3代喹諾酮類藥物的耐藥性稍有下降,但仍然維持了一個(gè)很高的水平,這種變化可能在一定程度上歸因于新藥的推廣以及近幾年對(duì)這些一到三代喹諾酮類藥物使用的逐漸減少,但是由于藥物之間的交叉耐藥性以及新出現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因在細(xì)菌之間的水平傳播,細(xì)菌的耐藥率仍然維持在很高的水平上;而大腸埃希菌分離株對(duì)加替沙星這種2002年在中國(guó)新上市的第四代氟喹諾酮類藥物的耐藥率則一直呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),由之前的10.7%上升到36.0%。

近年來(lái),對(duì)細(xì)菌喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)理研究有了新的發(fā)現(xiàn),過(guò)去認(rèn)為喹諾酮類藥物的耐藥性是由細(xì)菌染色體變異引起的,但新近研究表明質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥性也是其耐藥機(jī)制的重要組成部分。

質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥(PMQR)于1987年孟加拉國(guó)一場(chǎng)Ⅰ型痢疾志賀氏菌爆發(fā)中首次發(fā)現(xiàn)[12],與PMQR相關(guān)的基因命名為qnr[13]。本研究對(duì)1993年至2009年間分離的403株大腸埃希菌進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到3株qnrB陽(yáng)性菌株,2株qnrS陽(yáng)性菌株;aac(6′)-ib-cr是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因,其本質(zhì)上是一種氨基糖甙類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac(6′)-ib的變異體,故只能乙酰化含游離氨基的喹諾酮類,本研究中通過(guò)PCR和酶切鑒定共檢測(cè)到5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr基因陽(yáng)性菌株,其中 4株細(xì)菌分離于2008年,1株分離于2009年;耐藥基因qepA通過(guò)調(diào)控外排泵相關(guān)基因從而引起細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥水平的變化,本研究中共檢測(cè)到qepA陽(yáng)性細(xì)菌5株,陽(yáng)性率為1.2%,這其中4株陽(yáng)性菌株來(lái)自同一大型養(yǎng)殖場(chǎng),除1株對(duì)加替沙星中敏外,5株細(xì)菌對(duì)八種喹諾酮類藥物都表現(xiàn)出高度耐藥。

值得注意的是,2008年共檢測(cè)大腸埃希菌46株,其中1株細(xì)菌為qn rB陽(yáng)性,4株aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性,PMQR基因的檢出率為10.9%;而在2009年,共檢測(cè)細(xì)菌31株,其中2株為qnrB、2株qnrS和1株aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性細(xì)菌,PMQR基因的檢出率為16.1%。近幾年來(lái),PMQR基因在禽源大腸埃希菌中有不斷上升的流行趨勢(shì)。

以上結(jié)果顯示,近20年來(lái),我國(guó)禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增強(qiáng),已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然qnr、qepA和 aac(6′)-ib-cr僅介導(dǎo)低水平的喹諾酮類藥物耐藥性,但它們的存在有助于選擇出高水平的喹諾酮類藥物耐藥性[14]。一般認(rèn)為低水平耐藥性可使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到出現(xiàn)突變所需的濃度,從而出現(xiàn)高度耐藥。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因,不僅可垂直傳給子代,更重要的是可在不同微生物間進(jìn)行水平傳播,加快喹諾酮類藥物耐藥性在細(xì)菌間的傳播。因此非常有必要在我國(guó)開展質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥性的調(diào)查研究和耐藥機(jī)制研究,監(jiān)測(cè)PMQR基因的流行情況,合理使用抗生素,以期減少喹諾酮類藥物耐藥菌的產(chǎn)生、人獸共患病原菌間耐藥性的傳遞并為藥物的開發(fā)和臨床合理使用提供理論依據(jù)。

[1] 王曉泉,焦新安,陳祥,等.江蘇部分地區(qū)食源性和人源沙門氏菌的多重耐藥性研究[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(2):221-227

[2] Martinez-Martinez L,Pascual A,Jacoby G A.Quinolone resistance from a transferable plasm id[J].Lancet,1998,351:797-799.

[3] Jacoby G A,w alsh K E,M ills D M,et al.QnrB,an other plasm id-mediated gene for quinolone resistance[J].Antim icrob Agen ts Chemother,2006,50:1178-1182.

[4] Hata M,Suzuki M,Matsumoto M,et al.Cloning of a novel gene for qunoloine resistance from a transferable plasm id inShigella f lexneri2b[J].An tim icrob Agents Chemother,2005,49:801-803.

[5] Park C H,Robicsek A,Jacoby G A,et al.Prevalence in the U-nited States of aac(6')-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme[J].An tim icrob Agents Chemother,2006,50:3953-3955.

[6] Yamane K,W achino J,Suzuki S,et al.New plasm id-m ediated fluoroquinolone efflux pump,QepA,found in anEscher ichia coliclin ical isolates[J].An tim icrob Agents Chem other,2007,51:3354-3360.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institu te/CLSI.Performance standards for antim icrobial susceptibility testing;Nineteenth informational supplement.CLSIdocument M 100-S19[J].Clin-i caland Laboratory Standard s Institute,W aynet Pennsylvania,2009,28(1):1-134.

[8] Cattoir V,Poirel L,Rotim i V,et al.M ultiplex PCR for detection of plasm id-m ediated quinolone resistance qn r genes in ESBL-producing enterobacterial isolates[J].Antim icrob Agents Chemother,2007,60:394-397.

[9] YamaneK,W achino J,SuzukiS,et al.Plasmid-mediated qepA gene amongEscher ich ia coliclinical isolates from Japan[J].Antim icrob Agen ts Chemother,2008,52:1564-1566.

[10] Sambrook J,Russell DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002.

[11] Guerra B,Junker E,Schroeter A,et al.Phenotypic and genoty pic characterization of antim icrobial resistance in GermanEscherichia coliisolates from cattle,sw ine and pou ltry[J].J Antim icrob Chemoth,2003,52:489-492.

[12] Munshi M H,Sack D A,H aider K,et al.Plasm id-m ediated resistance to nalidix ic acid inShigella dysenteriaetype 1[J].Lan cet,1987,2:419-421.

[13] T ran JH,Jacoby G A.Mechan ism of plasm id-m ediated quinolone resistance[J].Proc Natl Acad SciUSA,2002,99:5638-5642.

[14] 劉健華,陳杖榴.喹諾酮類抗菌藥耐藥新機(jī)制[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(1):54-56.

Detection of Plasm id-mediated Quinolone Resistance amongEscherchia colifrom Avian in China

ZHANGWe-iqiu,PAN We-i juan,CHEN Xiang,JIAO Xin-an

(Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

A totalof 403E.colifield isolates were derived from clinically affected chickens in 18 provincesof China between 1993 and 2009.Of which 344E.coliisolates from 1990s were carried out to 8 quinoloneant-i m icrobial sensitivity test by using the K irby-Bauer method recomm ended by CLSI(clinical and laboratory standards institute).A ll of the isolates were detected for the presence of qnrA,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA by PCR and sequencing.E.coliisolates from 1993-1996 had a resistancemore than 60%only to Nalicixic acid(61.6%),w hereas isolates from 2001-2008 had a resistancem ore than 58%to 7 antibiotics.Among the403E.coliisolates from China,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA were detected in 3(0.7%),2(0.5%),5(1.2%),and 5(1.2%)isolates,respectively,no qnrA positive isolatew as detected in this study.The results showed that the resistance ofE.colito quinolone agents had been increasing in the past twenty years and therewas a rising prevalence ofE.coliisolates harboring plasm id-mediated quinolone resistance genes in China.

avian;Escherchia coli;quinolone resistance;p lasm id m ediation

S854.43

A

1007-5038(2010)04-0074-05

2010-03-24

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2008011);江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(09KJB230002);江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(K07016)

張維秋(1986-),女,山東臨沂人,碩士研究生,主要從事細(xì)菌耐藥方面的研究。*通訊作者

經(jīng)驗(yàn)交流