豬圈及其周邊社區(qū)環(huán)境大腸埃希菌氣溶膠產生及其傳播*

袁 文,柴同杰,周玉法,苗增民,張紅雙,秦 梅

(1.山東農業(yè)大學 動物科技與動物醫(yī)學院,山東泰安 271018;2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局,山東泰安 271000)

豬圈及其周邊社區(qū)環(huán)境大腸埃希菌氣溶膠產生及其傳播*

袁 文1,柴同杰*,周玉法2,苗增民1,張紅雙1,秦 梅1

(1.山東農業(yè)大學 動物科技與動物醫(yī)學院,山東泰安 271018;2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局,山東泰安 271000)

目的是以大腸埃希菌為指示菌研究豬舍環(huán)境中微生物氣溶膠產生及向其舍外環(huán)境的傳播。采用Andersen-6級空氣微生物樣品收集器和RCS-離心式采樣器分別在4個豬場舍內、舍外不同距離收集大腸埃希菌氣溶膠,計算每個采樣點大腸埃希菌的濃度;同時,采集豬的糞便,分離大腸埃希菌。利用ERICPCR技術,擴增其DNA條帶,形成聚類圖譜。通過每一個采樣點大腸埃希菌遺傳相似性分析及其濃度變化的比較,確認動物舍微生物氣溶膠向舍外環(huán)境的傳播模式。結果表明,4個豬場舍內空氣中大腸埃希菌的濃度遠遠高于舍外大腸埃希菌濃度(P＜0.05)。52.4%糞便大腸埃希菌與舍內空氣中的大腸埃希菌相似性可達90%以上;從豬場舍外下風方向分離到的多數大腸埃希菌(55%)與舍內空氣或糞便中分離的大腸埃希菌相似性可達90%以上。說明源于豬舍的微生物氣溶膠能夠傳播到舍外環(huán)境或居民社區(qū),具有流行病學及公共衛(wèi)生意義。

豬舍環(huán)境,大腸埃希菌氣溶膠,ERIC-PCR,遺傳相似性,流行病學及公共衛(wèi)生意義。

動物舍環(huán)境中的微生物及其代謝產物形成的氣溶膠不僅能夠導致環(huán)境污染,影響動物的健康及生產能力[1],而且還能導致氣源性傳染病的流行。很多包括細菌和病毒在內的氣載病原微生物都能夠通過空氣傳播很遠的距離,造成傳染病的流行[2]。大量的事實表明[3-4],高致病性病原微生物以氣溶膠的形式傳染,提醒人們警惕氣源性傳染病。

為證明動物舍微生物氣溶膠的來源及其向周圍環(huán)境的擴散,過去曾經通過動物舍氣溶膠濃度的變化[5]、在設計其周邊環(huán)境中分離的細菌不同耐藥性[6]等證明微生物氣溶膠的發(fā)生與傳播的。但是,用傳統(tǒng)的細菌學方法很難區(qū)分遺傳關系極為相近的菌株,其鑒別能力是有限的。為此,本試驗測量了4個豬場舍內及舍外不同距離的大腸埃希菌含量,在細菌學鑒定的基礎上,采用ERIC-PCR方法對不同地點分離的大腸埃希菌鑒定其同源性[7],獲得大腸埃希菌ERIC片段指紋圖譜,通過該片段在細菌基因組內的數量和分布之間的關系分析,比較其遺傳相似性,獲得其遺傳距離,確認了其發(fā)生及其傳播。

1 材料與方法

1.1 豬場情況

調查是從2008年3月到2009年2月在山東省棗莊市某豬場進行,采樣豬舍(40 m×10 m×3.5m)均是機械通風的封閉舍,存欄育肥豬120頭,每天進行1次糞便清理。采樣時記錄下當時的氣象指標(表 1)。

表1 被調查的4個豬舍氣象指標Tab le 1 Themeteorological index of four pig houses investigated

1.2 樣本的采集與處理

1.2.1 空氣樣品的采集 舍內采用Andersen-6級撞擊式微生物樣品收集器,氣流速度28.3 L/min,收集器設置于豬舍中央,高度為70 cm,根據不同衛(wèi)生條件驅動時間在1 m in～5m in之間;舍外(上風向10、50m 和下風向 10、50、100、200、400m)同時采用2臺 RCS-離心式采樣器,采樣高度距離地面約1.5m,氣流速度為40 L/m in,根據距離的遠近等因素收集時間在0.5 min～8 min之間,每個采樣點收集7個樣品,麥康凱培養(yǎng)基為采樣介質。

1.2.2 空氣樣品的處理 將樣品置于恒溫箱37℃培養(yǎng)18 h～24 h后,把培養(yǎng)基上的所有菌落經過“KOH反應”試驗鑒定其是革蘭陰性菌還是革蘭陽性菌。革蘭陰性菌再在麥康凱培養(yǎng)基上進行一次純分離培養(yǎng),然后用API 20E鑒定。統(tǒng)計采樣點大腸埃希菌的濃度(cfu/m3),并保存大腸埃希菌菌種。

1.2.3 糞便中大腸埃希菌的分離與鑒定保存 無菌收集新鮮的糞便樣品(10份/舍),置于冰盒內冷藏運輸,24 h內分離大腸埃希菌,并按照1.2.2方法鑒定保存。

1.3 模板的制備

用煮沸法制備大腸埃希菌模板,并在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ERIC-PCR

ERIC引物[8]由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。ERIC-PCR反應體系 25μL:10×buffer 2.5μL,0.2 mmol dNTPs,0.5UTaqDNA聚合酶,0.2 mmo lM gCl2,400 pmo l/L ERIC引物,3μL模板DNA,最后用滅菌雙蒸水補充至25μL。反應參數:95℃預變性7m in;94℃變性1m in,52℃退火1 min,68℃延伸 8 m in,共30個循環(huán);最后65℃延伸10 m in結束反應。

PCR產物經12 g/L～15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離(1×TAE為電泳緩沖液,EB染色,3 V/cm條件下電泳1～1.5 h),電泳結果在紫外分析儀(Tanon-2500,Shanhai,China)上照相。

1.5 ERIC-PCR結果分析

計算機軟件記錄下擴增及電泳普帶。利用NTSYS-pc 2.10軟件構建聚類樹狀圖。把每個分離株看作是一個分類學單位(OTU),并把相似性大于或等于90%的菌株看作起源相同的分離株[9]。

同一個豬舍內外環(huán)境和糞便中的大腸埃希菌均采用一個反應條件并同時一次完成,所有產物均使用同一塊凝膠進行電泳,以便減少誤差。

1.6 數據統(tǒng)計及分析

測得的大腸埃希菌濃度采用中間值表示,同時用最大值與最小值反映樣品間數值的波動范圍。所獲得實驗數據用Excel2003和Spss 11.5進行分析處理。

2 結果

2.1 舍內外不同距離空氣中大腸埃希菌含量

4個豬場舍內測得的氣載大腸埃希菌濃度分別為:35、23、27和 21 cfu/m3。4個豬舍外上風向 10、50m大腸埃希菌濃度分別為 A:4、2 cfu/m3;B:2、1 cfu/m3;C:3、2 cfu/m3;D:1、1 cfu/m3。下風向10m處大腸埃希菌濃度分別為18、18、14、9 cfu/m3;下風向50m 分別為7、3、8、4 cfu/m3;下風向100m 分別為3、2、1、2 cfu/m3;下風向 200m 分別為 1、2、1、1 cfu/m3;下風向400 m沒有分離到。

A、B、C、D豬場舍內與舍外不同距離(上風向10、50 m 和下風向 10、50、100、200、400 m)大腸埃希菌濃度差異顯著(P＜0.05);A、D豬場舍內與舍外上風向10、50m大腸埃希菌濃度差異顯著(P＜0.05),但是A、B豬場舍外不同距離間(10～200 m)的大腸埃希菌濃度差異不顯著(P＞0.05);下風向10、50 m處與上風向10、50 m處濃度差異顯著(P＜ 0.05)(表 2)。

2.2 ERIC-PCR結果

用ERIC-PCR方法對分離的大腸埃希菌的DNA進行擴增,得到了每一個豬場舍內外不同環(huán)境中大腸埃希菌的遺傳進化樹狀圖(圖1-4)。具有相同遺傳進化關系的大腸埃希菌具有相同的ERICPCR指紋圖譜[10]。

3 討論

通過比較豬舍內外的氣載大腸埃希菌的含量發(fā)現(表2),A、B、C和D舍內環(huán)境大腸埃希菌氣溶膠濃度高于舍外上風方向到50m處(P＜0.05),也高于舍外下風方向不同距離其濃度(P＜0.05)。但是,豬場A和D舍內氣載大腸埃希菌濃度與下風50m以內大腸埃希菌的濃度差異并不顯著(P＞0.05)。顯示了舍內微生物氣溶膠借助舍內外氣體交換,隨著氣流傳播到舍外一定距離,50 m內受其影響較重。另外,比較4個豬舍外下風方向在50、100和200m之間大腸埃希菌的濃度差異不顯著(P＞0.05),表明氣載大腸埃希菌在一定的氣象條件下可以傳播到舍外下風較遠的距離(≥200m)。在所有檢測的豬舍下風400m處都沒有檢測到大腸埃希

菌,原因可能是受到風力因素的影響,大腸埃希菌含量較低;或者由于紫外線、氧氣含量、各種各樣的污染物以及溫度、相對濕度等因素影響微生物在空氣中的存活;或因較長時間的采樣,應激因素對細菌的傷害導致部分細菌死亡,難以培養(yǎng)生長。

表2 4個豬場舍及其不同距離氣載大腸埃希菌的濃度(cfu/m空氣)(n=7)Table 2 The con cen tration of E.coli at different distan ce of the four pig houses(n=7)

圖1 豬舍A中,從不同采樣點分離的大腸桿菌遺傳關系聚類樹狀圖Fig.1 The genetic relationship dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm A

圖2 豬舍B中,從不同采樣點分離的大腸埃希菌 遺傳關系聚類樹狀圖 Fig.2 The genetic relationsh ip dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm B

圖3 豬舍C中,從不同采樣點分離的大腸桿菌遺傳關系聚類樹狀圖Fig.3 The genetic relationship dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm C

圖4 豬舍D中,從不同采樣點分離的大腸埃希菌 遺傳關系聚類樹狀圖 Fig.4 The genetic relationsh ip dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm D

ERIC-PCR技術是利用ERIC核心的高度保守反向重復序列設計引物進行PCR,作為一種準確可靠的分子鑒定技術,用于細菌病原學和分子流行性病學研究[9]。本試驗中,ERIC-PCR擴增產物電泳圖象經過軟件分析自動生成了矩陣圖,并利用NTSYS-pc 2.10軟件構建了聚類樹狀圖,經過分析,獲得不同菌株之間的相似性。這種方法能夠有效地鑒定從同一豬舍不同采樣點采集到的大腸埃希菌之間的遺傳距離及其相似性。ERIC-PCR結果表明(圖1-4),52.4%糞便大腸埃希菌(4個豬舍分別為:2/4,50%;2/4,50%;3/6,50%;4/7,57.1%)與舍內空氣中的大腸埃希菌相似性可達90%以上,表明舍內空氣中的這些大腸埃希菌是由糞便中的同一菌株繁殖而來,來源相同。也就是說,糞便中的大腸埃希菌可以形成氣溶膠,污染舍內空氣。

從豬場舍外下風方向10、50、100、200 m 分離到的多數大腸埃希菌(55%,23/42)與舍內空氣或糞便中分離的大腸埃希菌相似性可達90%以上,如豬舍A中Downw ind10m-2與Feces-2;Downw ind50m-1與Feces-1、Indoor-4的相似性為100%等。表明糞便中或舍內空氣中的大腸埃希菌可以通過舍內外氣體交換傳播到舍外。

而從豬舍上風分離到的大腸埃希菌與舍內空氣或糞便中的大腸埃希菌相似性較小,在66%～89%之間。表明從上風方向分離到的這些大腸埃希菌與舍內動物糞便或舍內空氣中的遺傳距離差別較大,有其它來源。

通過以上結果看出,ERIC-PCR對細菌鑒定的準確性和可靠性。在所測量的4個豬場舍內,豬的糞便中的大腸埃希菌能夠經過一定的理化過程形成氣溶膠,進入氣懸狀態(tài),對本豬群或飼養(yǎng)人員的健康形成威脅。而且,他們能夠隨著舍內外氣體的交換傳播到周圍環(huán)境或社區(qū),對牧場周邊環(huán)境造成生物污染,或造成病原體的擴散,致使傳染病的流行。以大腸埃希菌作為一種指示菌來研究動物舍中微生物氣溶膠向周圍環(huán)境的傳播,具有獸醫(yī)公共衛(wèi)生學和流行病學意義。

致謝:本研究獲得中國國際合作項目“動物疫源性人畜共患病病原體氣溶膠的監(jiān)測”[2009DFA32890]。

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ERIC-PCR Identification of the Formation and Sp reading ofEscherichia coliAerosols in Pig Houses

YUANWen1,CHAI Tong-jie*1,ZHOU Yu-fa2,M IAO Zeng-m in1,ZHANG Hong-shuang1,Q IN M ei1

(1.College of Animal Science,Shandong Ag ricultural University,Tai’an,Shandong,271018,Ch ina;2.Farm ing Bureau of Daiyue District in Taian City,Tai’an,Shandong,271000,China)

In order to have a full understanding of the form ation ofm icrobial aerosols in pig houses and of their spreading to surroundings,w ithEscherichia coli(E.coli)as the indicator bacterium.we collected theE.coliaerosols from 4 pig housesand their surroundings at different points,and calculated the concentration ofE.coliat each sam pling point.A t the sam e time,we collected the feces of pigs to separateE.coli.By the app lication of ERIC-PCR technology,we aimed to estab lish a cluster spectrum by w idening the DNA band ofE.coliisolates collected from different sam pling points.By analyzing the genetic sim ilarity ofE.coliiso lates and comparing the concentration change ofE.coli,weattem pted tom ake clear how m icrob-i al aerosols are formed in pig houses and spread to thesurroundings.The results showed that concentrations of airborneE.coliin the 4 pig houses were much higher than thosemeasured outdoor(P＜0.05).The ERIC-PCR resu lts also showed that52.4%of the fecalE.coliw ere identical to the indoor airborneE.coli-i solates,and there was more than 90%similarity between the majority ofE.coli(55%)isolated from downw ind air and those from indoor air or feces.The aerosols formed in a pig house can spread to the surroundings and to residential areas,and thus this study is of epidem io logical and pub lic health significance.

pig house;airborneEscherichia coli;ERIC-PCR;sim ilarity;epidem iological and public health significance

S851.24

A

1007-5038(2010)04-0027-05

2010-03-24

袁 文(1982-),女,山東濟南人,研究方向為動物微生物學。*通訊作者