P33ING1在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與腫瘤細(xì)胞凋亡的研究

楊承綱 胡早秀 陳 蕓

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中90% 以上是膀胱移行細(xì)胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)。Garkavtsev等[1]采用在消減cDNA雜交(substractive hybridization)的基礎(chǔ)上，結(jié)合GSE(genetic suppressor element)方法，克隆出1個(gè)新基因命名為inhibitor of growth 1(ING1)，ING1基因的主要蛋白翻譯產(chǎn)物為P33ING1 蛋白。我們采用鏈霉素抗生物蛋白-過(guò)氧化酶免疫組化染色(lablled streptavidin biotin,SP)法，檢測(cè)P33ING1在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并探討P33ING1與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集云南省腫瘤醫(yī)院病理科2000年1月～2007年10月收治的83例膀胱移行細(xì)胞癌組織及11例正常膀胱黏膜組織。83例BTCC中，男性63例，女性20例，年齡35～84歲，平均年齡59.5歲。病理檢查前均未接受過(guò)放療和化療，術(shù)后均進(jìn)行化療藥物膀胱灌注。按WHO病理組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，G129例，G231例，G323例；Tis～T1期(淺表性腫瘤)51例，T2～T4期(浸潤(rùn)性腫瘤)32例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。術(shù)后隨訪16個(gè)月～5年，平均38個(gè)月，失訪5例，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移56例，死亡2例，無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移20例。

1.2 方法

1.2.1 羊抗人p33ING1 單克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品，抗體稀釋度為1∶50,SP染色試劑盒、DAB顯色劑、抗體稀釋液購(gòu)自福州邁新公司。采用S-P法進(jìn)行免疫組化染色，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定： p33ING1陽(yáng)性大多數(shù)定位于細(xì)胞核，少數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[2]，每例在光鏡下(400×)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞百分比。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的x-dUTP切口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTP-nick end labeling method,TUNEI法)試劑盒購(gòu)于福州邁新公司。

切片脫蠟水化，3%H2O2清除內(nèi)源性過(guò)氧化酶10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；加TBS 1∶100蛋白酶K，37℃消化10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；每片加TDT和DIG-d-UTP各1 μl，標(biāo)記緩沖液18 μl，40℃冰箱過(guò)夜，TBS洗2 min×3次；加封閉液50 μl，室溫30 min；封閉液1∶100生物素化地高辛抗體50 μl，37℃反應(yīng)30 min；TBS洗2 min×3次；加TBS 1∶100稀釋SABC，37℃反應(yīng)30 min；TBS洗5 min×4次；DAB顯色，蘇木精襯染，脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)中以不含TDT的試劑作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：TUNEL法檢測(cè)陽(yáng)性表現(xiàn)為在腫瘤組織中散在分布胞核呈棕黃色顆粒著色的細(xì)胞。在400倍光鏡下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野并計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/1 000)×100%[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

83例膀胱移行細(xì)胞癌中,49例(59.03%) P33ING1表達(dá)陽(yáng)性，AI=1.4335±0.3863。83例標(biāo)本中，凋亡細(xì)胞范圍為0～27個(gè)‰。AI表達(dá)正常膀胱黏膜組織明顯低于BTCC組織(P<0.01)。在BTCC組織中，AI水平隨其病理分級(jí)的增高而增高，各級(jí)間差異有顯著性(P<0.01)；Tis～T1期AI水平明顯低于T2～T4期(P<0.01)；復(fù)發(fā)死亡組AI水平明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)組(P<0.05)。AI與BTCC病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系(表1)。

表1 AI 與BTCC組織臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.1 P33ING1蛋白表達(dá)及AI與膀胱移行細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

P33ING1蛋白表達(dá)G1、G2與G3比較差異有顯著性(P<0.05)，G1與G2比較差異無(wú)顯著性 (P>0.05)；G1、G2與G3比較及Tis～T1與T2～T4比較AI均有顯著性差異(P均<0.01)。5年復(fù)發(fā)死亡組AI顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)組；P33ING1蛋白表達(dá)率復(fù)發(fā)死亡組顯著低于無(wú)復(fù)發(fā)組。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),P33ING蛋白表達(dá)與BTCC病理分級(jí)及臨床分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-0.263,P=0.016；γ=-0.388,P=0.001)；AI與BTCC病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系(γ=0.642,P=0.000；γ=0.455，P=0.000)；AI與P33ING1蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 P33ING1表達(dá)及AI與BTCC臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系(例，%)

2.2 P33ING1蛋白表達(dá)與AI的關(guān)系

P33ING1陽(yáng)性表達(dá)者AI(1.5255±0.4298)顯著高于P33ING1陰性表達(dá)者(1.2924±0.3185),P<0.05。

3 討論

ING1 基因是1種重要的抑癌基因，定位于人類(lèi)染色體13q33-34，由外顯子1a和外顯子2轉(zhuǎn)錄翻譯出的P33ING1蛋白是ING1基因的主要蛋白翻譯產(chǎn)物 。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P33ING1表達(dá)降低可使細(xì)胞生長(zhǎng)加快，而過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用[4]。其與p53有相互依賴作用，參與p53介導(dǎo)的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動(dòng)，能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)損傷修復(fù)。其低表達(dá)則可刺激克隆形成，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[5]。Helbing等[6]通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞死亡敏感試驗(yàn)，證實(shí)P33ING1 有促細(xì)胞凋亡的作用。Nouman等[7]證實(shí)P33ING1 與p53基因是相互協(xié)同、相互依賴的方式，通過(guò)激活p21/WAF1的轉(zhuǎn)錄來(lái)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，兩者一起表達(dá)才能起抑制細(xì)胞增殖，認(rèn)為P33ING1 的異常表達(dá)阻止了p53促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而形成了腫瘤。有研究報(bào)道P33ING1蛋白在人的頭頸部鱗癌、胃癌、結(jié)腸癌及乳腺癌中均有ING1基因表達(dá)下降[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)，P33ING1表達(dá)在正常對(duì)照組中陽(yáng)性率為90.9%,而在膀胱移行細(xì)胞癌中陽(yáng)性率為50.3%，表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，差別顯著，與以上文獻(xiàn)報(bào)道的一致，表明P33ING1失表達(dá)在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。祝峙等[9]采用脂質(zhì)體方法，將P33ING1與wtp53基因分別轉(zhuǎn)染人HepG2、PLC/PRF/5和HeP3B三株內(nèi)源性p53基因表達(dá)狀態(tài)各不相同的肝癌細(xì)胞株，以探討P33ING1與p53基因間的協(xié)同功能對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在表達(dá)內(nèi)源性wtp53的HepG2細(xì)胞中導(dǎo)入外源性P33ING1基因，使P33ING1 蛋白在HepG2細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)，Western印跡結(jié)果顯示在HepG2細(xì)胞內(nèi)，隨著P33ING1 蛋白表達(dá)量升高，p53蛋白表達(dá)也增強(qiáng)。過(guò)表達(dá)P33ING1 使HepG2細(xì)胞凋亡率上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為P33ING1陽(yáng)性表達(dá)者AI顯著高于陰性表達(dá)者，與以上文獻(xiàn)報(bào)道的一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P33ING1蛋白表達(dá) G1、G2與G3間比較差異有顯著性，G1與G2比較差異無(wú)顯著性；P33ING1蛋白在Tis～T1與T2～T4間表達(dá)有顯著性差異。提示P33ING1蛋白高表達(dá)多發(fā)生在分化好及淺表的膀胱癌中。AI在G1、G2與G3間表達(dá)及Tis～T1與T2～T4間表達(dá)有顯著性差異，提示在分化差及浸潤(rùn)性膀胱癌中細(xì)胞凋亡率上升。復(fù)發(fā)死亡組顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)組；P33ING1蛋白表達(dá)復(fù)發(fā)死亡組顯著低于無(wú)復(fù)發(fā)組。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),P33ING蛋白表達(dá)與BTCC病理分級(jí)及臨床分期呈負(fù)相關(guān)；AI與其病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)。提示在膀胱癌中AI高P33ING1低表達(dá)者的預(yù)后較差。P33ING1陽(yáng)性表達(dá)時(shí)AI顯著高于陰性表達(dá)時(shí)，但其與AI無(wú)相關(guān)性，提示過(guò)表達(dá)P33ING1 使膀胱癌細(xì)胞凋亡率上升，但細(xì)胞凋亡是1個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，是多因素多環(huán)節(jié)的結(jié)果，并不是由幾個(gè)基因所決定的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，P33ING1失表達(dá)在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，檢測(cè)p33ING1水平的變化情況可能有重要的意義。同時(shí)檢測(cè)AI的狀態(tài)和p33ING1表達(dá)水平,對(duì)于膀胱癌的預(yù)后判斷可能具有積極意義。

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