微乳薄層色譜用于糖分離的研究*

孫 悅 張 茜 畢靜文 李君杏

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院,廣州 510006； 2.淄博市中醫(yī)醫(yī)院，淄博 255300)

多糖具有復(fù)雜多樣的生物活性和功能，多糖的單糖組成測(cè)定是控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提供多糖基本信息的重要環(huán)節(jié)。因單糖存在互變異構(gòu)體、差向異構(gòu)體、結(jié)構(gòu)相似等特征，必須采用高效的分離技術(shù)方可實(shí)現(xiàn)系列單糖的有效分離[1]。

微乳液是由乳化劑、助乳化劑、油相和水相組成的光學(xué)上各向同性、熱力學(xué)穩(wěn)定的液-液分散體[2]，只要組分的比例合適即可自發(fā)形成均勻透明或微呈乳光的體系并保持穩(wěn)定。以微乳液為流動(dòng)相進(jìn)行的色譜稱(chēng)為微乳色譜[3]。根據(jù)膠束色譜理論[4]，當(dāng)流動(dòng)相中存在膠束及兩性表面活性劑,展開(kāi)系統(tǒng)即具增溶、降低界面張力作用，并且因靜電、疏水及立體等效應(yīng)，使其具有獨(dú)特的選擇性，可同時(shí)分離親水物質(zhì)和疏水物質(zhì)，對(duì)帶電成分和非帶電成分亦有較好的分離選擇，適用于分離差別很小的物質(zhì)。已有將微乳液用于薄層分離黃酮[5，6]、生物堿[7，8]、氨基酸[9]等的報(bào)道，而把微乳液作為展開(kāi)劑分離鑒定糖類(lèi)的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

薄層色譜在成本、操作、檢測(cè)、批量分析方面具有獨(dú)特優(yōu)越性，而且還可以作為現(xiàn)代色譜分析方法的預(yù)行為測(cè)試。筆者以十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正庚烷-水微乳液為展開(kāi)劑，研究了糖的微乳薄層色譜行為，以期為糖的分析提供新的研究思路。研究結(jié)果表明，微乳液作展開(kāi)劑分離小分子糖可大大減少糖的脫尾現(xiàn)象，有較好的增敏作用，30%～60%微乳液可對(duì)糖在硅膠G-0.3 mol/L NaH2PO3-0.5%CMC-Na板上得到較好的分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:GZX-9240MBE型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

雙槽薄層色譜展開(kāi)缸：10 cm×10 cm，上海信誼儀器廠；

電動(dòng)噴霧器：YOKO-PN型，武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；

噴霧顯色抽氣箱：YOKO-PX型，武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-DШ型，鞏義市英峽矛華儀器廠；

天平：MP200A型， 0.001 g，上海良平儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇金壇市宏華儀器廠；

D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖對(duì)照品：上海伯奧生物科技有限公司；

槐米:市售，由廣東藥學(xué)院鑒定為正品；

實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 薄層板的制備

按1 g硅膠G、3 mL 0.5%CMC-Na的比例加入研缽中研勻,用涂布器涂布，晾干后于105℃烘30 min，于干燥箱中備用。分別配制含有0.1 mol/L硼酸的0.5%CMC-Na溶液以及含有0.3 mol/L NaH2PO3的0.5%CMC-Na溶液，分別制備0.1 mol/L硼酸板、0.3 mol/L NaH2PO3板。

(2)微乳液展開(kāi)劑的制備

按照文獻(xiàn)方法[7]，在保證十二烷基硫酸鈉、正丁醇、正庚烷質(zhì)量比為0.27∶0.63∶0.10的條件下，改變水量，配制系列微乳液。按上述質(zhì)量比取SDS、正丁醇、正庚烷，于研缽中加適量水研磨,然后加水至足量，混勻，放置24 h，微乳液的成分配比及結(jié)構(gòu)列于表1。

(3)供試品溶液的配制

稱(chēng)取槐花米粗粉20 g(壓碎)，加沸水300 mL，加熱煮沸30 min，紗布趁熱過(guò)濾，殘?jiān)ㄔ俨僮饕淮?，合并兩次濾液，室溫放置析晶，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為蕓香苷，減壓抽濾，用蒸餾水洗滌蕓香苷，抽干，得粗制蕓香苷，置空氣中風(fēng)干。

取粗制蕓香苷，加蒸餾水煮沸，全部溶解后，趁熱抽濾，冷卻析晶后抽濾，得蕓香苷精制品，置空氣中干燥。

表1 微乳液的成分配比及結(jié)構(gòu)

注：“w/o”為油包水型；“w/o-o/w”為油、水雙連續(xù)型；“o/w”為水包油型。

取精制蕓香苷，研細(xì)后加2%硫酸加熱回流30 min，此時(shí)，瓶中的混濁液逐漸變?yōu)槌吻宓淖攸S色液體，最后生成鮮黃色沉淀，放冷沉淀，抽濾，取濾液加飽和氫氧化鋇溶液中和至中性，濾去沉淀，濾液于水浴60℃濃縮，加乙醇溶解并定容至10 mL[10]。

(4)對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱(chēng)取D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖各10 mg，用70%乙醇定容至10 mL，得各糖的濃度約為10 mg/mL。

(5)糖樣品實(shí)驗(yàn)

以40%微乳液為展開(kāi)劑，于室溫上行法展開(kāi)，于硅膠G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板上對(duì)蕓香苷水解糖溶液、L-鼠李糖、D-葡萄糖進(jìn)行分離。展程約8 cm，取出晾干，噴以苯胺-二苯胺-磷酸，噴后于105℃加熱10 min顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 展開(kāi)劑的選擇

糖的薄層分析多用有機(jī)溶劑作展開(kāi)劑，敖利[11]分別用正丁醇-丙酮-水和正丁醇-甲醇-丙酮-水分離了紅參和麥冬，實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)有機(jī)溶劑正丁醇-丙酮-水(體積比為10∶10∶2.5)和正丁醇-甲醇-丙酮-水(體積比為10∶4∶8∶2.5)以及不同含水量的微乳液為展開(kāi)劑，于室溫上行法展開(kāi)，在硅膠G-0.5%CMC-Na板上對(duì)D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖進(jìn)行分離，用苯胺-二苯胺-磷酸顯色。

顯色后，果糖為橙紅色斑點(diǎn)，葡萄糖為淺藍(lán)色斑點(diǎn)，蔗糖為褐色斑點(diǎn)，半乳糖為深綠色斑點(diǎn)，鼠李糖為淺綠色斑點(diǎn)。用含水量20%、30%、40%、50%的微乳液作展開(kāi)劑時(shí)，各糖可以得到圓而集中的斑點(diǎn)，更大含水量的微乳液為展開(kāi)劑時(shí)，斑點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)拖尾，含水量80%微乳液作展開(kāi)劑時(shí)，薄層板上看不到斑點(diǎn)。正丁醇-丙酮-水(體積比為10∶10∶2.5)和正丁醇-甲醇-丙酮-水(體積比為10∶4∶8∶2.5)為展開(kāi)劑時(shí)各斑點(diǎn)均有很大的拖尾。但無(wú)論以何種溶液作展開(kāi)劑，若將實(shí)驗(yàn)用5種糖混合，在硅膠板上均不能很好地分開(kāi)。從比移值來(lái)看，各糖比移值由大到小的順序?yàn)椋何逄继?鼠李糖)、六碳酮糖(果糖)、六碳醛糖(葡糖糖、半乳糖)、二糖(蔗糖)；唯一例外的是以正丁醇-甲醇-丙酮-水作展開(kāi)劑時(shí)，葡萄糖比移值顯示略大于果糖。

以各微乳液含水比例為橫坐標(biāo)，以各糖比移值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)，如圖1所示。由圖1可以看出含水量不同的各微乳液對(duì)各糖的分離效果。含水量在30%～60%之間時(shí)比移值有一定差異，但含水量60%時(shí)，斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象，因此選擇含水量40%微乳液作為微乳展開(kāi)條件。

1—鼠李糖； 2—果糖； 3—葡萄糖； 4—半乳糖； 5—蔗糖

2.2 薄層板的選擇

糖的薄層色譜分析已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，糖的極性較大，采用無(wú)機(jī)鹽緩沖液調(diào)硅膠G板，使分離效果改善[11]。因此，以40%微乳液為展開(kāi)劑，分別于硅膠G-0.5% CMC-Na板、硅膠G-0.5% CMC-Na-0.3 mol/L NaH2PO3板、硅膠G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板上對(duì)D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖進(jìn)行分離，用苯胺-二苯胺-磷酸顯色分離。從斑點(diǎn)效果上看，用硼酸溶液作薄層板比用硅膠G作薄層板分離的斑點(diǎn)集中。因此，選擇硅膠G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板進(jìn)行樣品分離。

2.3 糖樣品的分離

蕓香苷水解糖的傳統(tǒng)分離法是紙色譜法，分離所得斑點(diǎn)較為分散，而且用紙色譜分離，對(duì)檢測(cè)所用試劑有所限制。在2.1和2.2條件基礎(chǔ)上，用40%微乳液作展開(kāi)劑，在硅膠G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板上進(jìn)行了蕓香苷水解糖的分離，分離結(jié)果滿(mǎn)意，與傳統(tǒng)分離方法[10]相比，微乳液作展開(kāi)劑分離所得斑點(diǎn)更為集中，故而靈敏度更高。

3 結(jié)語(yǔ)

以十二烷基硫酸鈉為表面活性劑，正丁醇為助表面活性劑，正庚烷為油相，水為水相的微乳液作展開(kāi)劑對(duì)糖在硅膠板上進(jìn)行了分離分析。與傳統(tǒng)展開(kāi)劑相比，含水20%～60%的微乳液作展開(kāi)劑在硅膠板上分離糖，均可得到規(guī)則清晰、圓而集中、不擴(kuò)散不拖尾的斑點(diǎn)，將該法用于槐米蕓香苷水解糖樣品的分離，得到理想的分離效果。

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