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    123I-3H11在荷瘤裸鼠體內(nèi)的SPECT顯像

    2010-01-26 05:22:13秦紅斌高惠波陳大明金小海白紅升李存福雷衍慶
    核化學(xué)與放射化學(xué) 2010年5期
    關(guān)鍵詞:靶細(xì)胞荷瘤單克隆

    秦紅斌,高惠波,陳大明,楊 志,金小海,白紅升,李存福,雷衍慶,尹 衛(wèi),*

    1.原子高科股份有限公司,北京 102413;2.北京大學(xué) 臨床腫瘤學(xué)院,北京腫瘤醫(yī)院暨北京腫瘤防治研究所 核醫(yī)學(xué)科,北京 100036

    胃癌的死亡率居我國(guó)各種癌癥之首,患者就診時(shí)多屬進(jìn)展期,對(duì)放、化療不敏感,根治手術(shù)效果不理想,迫切需要探索新的診治方法[1]。應(yīng)用單克隆抗體可以特異性的識(shí)別惡性腫瘤[2]。單克隆抗體3H11與胃癌組織具有高陽(yáng)性反應(yīng)率、高選擇性及高親和力的特點(diǎn)[3]。3H11對(duì)多種腫瘤組織具有良好的結(jié)合特性,并已成功地用于原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶的臨床顯像診斷[4-5]。免疫熒光顯示,著染部位限于靶細(xì)胞的質(zhì)膜,并得到免疫電鏡的證實(shí)[6]。其對(duì)應(yīng)抗原為210 kD的蛋白質(zhì),基本不含糖[7-8]。近年來(lái),研究者采用131I標(biāo)記的單克隆抗體3H11對(duì)胃癌的導(dǎo)向治療進(jìn)行了廣泛的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),并取得了一定的研究成果[9-10]。王川等[11]研究了125I-3H11在胃癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)的應(yīng)用價(jià)值,在臨床取得較滿意的效果。張梅穎等[12]采用131I-3H11在荷人胃癌移植瘤中進(jìn)行γ相機(jī)攝片,結(jié)果表明,標(biāo)記物可明顯地濃聚在腫瘤部位,可獲得較清晰的圖像,但標(biāo)記物大部分仍在血池中,這就可能造成它的腫瘤定位、特別是探測(cè)處于高本底部位的病灶不夠理想。為了探索更好的顯像效果,本工作擬采用核性質(zhì)優(yōu)異的123I作為顯像核素標(biāo)記單抗3H11,并對(duì)標(biāo)記物在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行觀察和SPECT顯像,探討標(biāo)記物作為胃癌和轉(zhuǎn)移瘤診斷顯像劑的可能性,為臨床應(yīng)用提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與裝備

    FT-603井型γ閃爍探頭-FH463A智能定標(biāo)儀,北京核儀器廠;AR2130型電子天平,感量0.001 g,美國(guó)OHAUS公司;單道可調(diào)移液器,美國(guó)Eppendorf公司;PD-10柱,瑞典GE Healthcare公司;Whatman No.1試紙,英國(guó)Whatman公司;Haier BCD-278A/C普通冰箱,市售;單光子發(fā)射體斷層掃描儀(SPECT),德國(guó)Simens公司;京立LD5-10離心機(jī),北京京立離心機(jī)有限公司。

    1.2 主要材料與試劑

    小鼠單克隆抗體3H11、胃癌BGC823細(xì)胞,北京腫瘤研究所惠贈(zèng);牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),北京博奧森生物技術(shù)有限公司;Na123I溶液,原子高科股份有限公司;胃癌荷瘤裸鼠BALB/C(6~8周齡),SPF級(jí),體重18~20 g,雌性,均于右前腿根部背側(cè)接種2×106個(gè)BGC823細(xì)胞,8~10 d后腫瘤直徑為0.8~1.0 cm,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;其余化學(xué)試劑均為分析純,購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

    1.3 3H11標(biāo)記物親和常數(shù)測(cè)定

    采用文獻(xiàn)[13]報(bào)道的優(yōu)化條件進(jìn)行3H11的123I標(biāo)記及標(biāo)記物的純化。123I-3H11與BGC823靶細(xì)胞的親和常數(shù)采用96孔板法測(cè)定。按照每孔3×104個(gè)BGC823細(xì)胞包被到96孔板,于4 ℃放置過(guò)夜,棄去培養(yǎng)液并用200 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,含0.1% BSA,pH=7.4,0.01 mol/L)洗滌3次;每孔加入含5% BSA的PBS 200 μL封閉,37 ℃孵育1 h;將123I-3H11按倍比稀釋法配成系列濃度,分別與包被的靶細(xì)胞結(jié)合,反應(yīng)平衡后,按上述方法洗滌,洗滌后每孔加入200 μL的2 mol/L NaOH溶液,37 ℃下消化細(xì)胞20 min;收集每孔的細(xì)胞消化液,并且使用PBS洗3次,合并至消化液中;在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定每管試樣為總結(jié)合(TB),并測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)樣的放射性計(jì)數(shù)。非特異性結(jié)合(NBS)每孔再加入200 ng(100 μL)抗體3H11,置于37 ℃孵育1 h后洗滌3次,消化后測(cè)γ計(jì)數(shù)。

    1.4 123I-3H11免疫活性測(cè)定

    取1支放免管加入人血清0.5 mL(5×104個(gè))后再加入1.5 mL PBS記為N管;另取1支放免管加入BGC823細(xì)胞1 mL(5×104個(gè))后再加入1 mL PBS記為O管。N管和O管室溫放置30 min后離心6 min(3 000 r/min),離心后取走余液。在離心后的N管和O管中分別加入123I-3H11標(biāo)記物10 μL(3H11質(zhì)量濃度0.01 mg/L),搖勻成懸浮液,37 ℃溫育30 min,分別加入2 mL PBS,離心20 min,去上清液,測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。再另取1支放免管加入10 μL123I-3H11標(biāo)記物作為標(biāo)準(zhǔn)液,記為T管,測(cè)定總放射性計(jì)數(shù)。按式(1)計(jì)算標(biāo)記單抗3H11免疫活性。

    (1)

    1.5 123I標(biāo)記3H11在胃癌BGC823裸鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)

    1.5.1胃癌裸鼠的生物分布 選用15只BALB/C胃癌裸鼠隨機(jī)分為3組,每組5只,每只自尾靜脈注射0.1 mL活度約1.11 MBq的123I-3H11,并于注射后2、24、48 h眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、骨、甲狀腺,稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)。由于123I半衰期短,為了便于校正放射性衰變,取0.1 mL注射液作標(biāo)準(zhǔn),與上述生物樣品同時(shí)測(cè)量。最后經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)和腫瘤組織(T)與正常組織(NT)攝取放射性比(T/NT)。

    1.5.2荷瘤裸鼠的SPECT顯像 隨機(jī)取3只荷人胃癌的BALB/C裸鼠(裸鼠封閉甲狀腺)于尾靜脈分別注射約7.4 MBq123I-3H11并于注射后2、24 h行SPECT顯像。顯像條件為:低能、高分辨、平行孔準(zhǔn)直儀,128×128像素,每只小鼠采集50 000~150 000的放射性計(jì)數(shù)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 3H11標(biāo)記物親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果

    123I-3H11與BGC823靶細(xì)胞結(jié)合的飽和曲線(Prism 5.0軟件作圖)結(jié)果示于圖1。對(duì)于BGC823靶細(xì)胞而言,有其固有的親和力,當(dāng)123I-3H11的濃度從零開(kāi)始增加時(shí),復(fù)合物123I-3H11-BGC823的量先快速上升,后逐漸變慢,表明其親和力高(一般上升越快,親和力越高),當(dāng)標(biāo)記物的濃度達(dá)278.1 pmol/L時(shí),靶細(xì)胞絕大部分被飽和,通過(guò)Prism 5.0軟件計(jì)算Kd=6.255×10-9mol/L,說(shuō)明標(biāo)記物具有特異性、高親和力。

    圖1 BGC823細(xì)胞與123I-3H11放射性配基結(jié)合分析飽和曲線Fig.1 Saturation binding of 123I-3H11 to BGC823 cells●——TB,◆——SB,▲——NSB

    2.2 123I-3H11免疫活性測(cè)定結(jié)果

    在定標(biāo)儀上測(cè)定N管、O管和T管的10 s放射性計(jì)數(shù),結(jié)果分別為291、3 282、4 349。

    按式(1)計(jì)算得到標(biāo)記物的免疫活性為68.8%,標(biāo)記后單抗免疫活性有一定的損傷。

    2.3 123I標(biāo)記3H11在荷人胃癌BGC823裸鼠的體內(nèi)評(píng)價(jià)結(jié)果

    2.3.1荷瘤裸鼠的生物分布結(jié)果123I -3H11在荷人胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布示于圖2。從圖2可以看出,標(biāo)記物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后,從血液迅速清除,注射標(biāo)記物2 h后放射性攝取(Dinj)為(10.35±1.79) %ID/g,24 h后回落到(3.81±0.81) %ID/g;肝對(duì)123I-3H11的放射性攝取2 h時(shí)高達(dá)(8.02±2.52) %ID/g;腎對(duì)123I-3H11攝取2 h時(shí)高達(dá)(6.72±1.16) %ID/g,標(biāo)記物可能從肝、腎代謝;123I為親甲狀腺核素,當(dāng)在體內(nèi)脫落后沉積于甲狀腺中,本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示,隨著時(shí)間延長(zhǎng)甲狀腺中的放射性有增高趨勢(shì),并且較其它組織中有明顯的偏高,說(shuō)明了123I-3H11體內(nèi)有脫碘現(xiàn)象;標(biāo)記物進(jìn)入靶腫瘤較快,從注射后2 h的(4.35±1.45) %ID/g增至24 h的(11.06±1.86) %ID/g,有利于盡早開(kāi)始SPECT顯像;腫瘤部位放射性濃度維持了一個(gè)較高的水平,而且隨時(shí)間延長(zhǎng)略有升高,由此表明,單克隆抗體3H11的123I標(biāo)記物具有一定的腫瘤特異性。123I-3H11在荷胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布T/NT比值列于表1,從表1結(jié)果可以分析出,標(biāo)記物特異性地濃集于腫瘤,而其他組織的放射性攝取較少,即T/NT的放射性活度比值高,注射后24 h腫瘤與血、腸、肌肉比分別為2.90±0.06、17.01±0.26、15.58±0.82;標(biāo)記物從腫瘤清除較慢,保證了顯像時(shí)間充足;注射標(biāo)記物24 h后腫瘤與肝、肺、腸、胃、骨等的T/NT達(dá)到較大比值,因此可以考慮藥物注射后24 h為較佳顯像時(shí)間。

    圖2 123I-3H11在荷胃癌裸鼠體內(nèi)生物分布柱狀圖Fig.2 Biodisribution of 123I-3H11 in the bearing mice1——血(Blood),2——腫瘤(Tumor),3——甲狀腺(Hypothyroid),4——肝(Liver),5——腎(Kidney),6——肺(Lung),7——胃(Stomach),8——脾(Spleen),9——心(Heart),10——腸(Intestine),11——骨(Bone),12——肌肉(Muscle)

    2.3.2荷瘤裸鼠的SPECT顯像結(jié)果 荷瘤裸鼠分別注射123I-3H11后2、24 h行SPECT顯像,從各時(shí)刻顯像圖看,血中放射性本底早期較高,標(biāo)記物主要存在于血液中,肝、腎等器官血運(yùn)豐富,放射性分布較多而顯影明顯,腫瘤部位積聚少量顯像劑,腫瘤輪廓較清晰(圖3(a));隨著血液中標(biāo)記物的清除,心臟、腎、肺和胃等器官放射性攝取整體也隨血液清除的增多而降低,腫瘤部位濃聚顯像劑增多,腫瘤顯像更清晰(圖3(b))。荷瘤裸鼠的SPECT顯像結(jié)果與裸鼠體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果基本一致。

    表1 123I-3H11在荷胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布T/NT比值Table 1 T/NT ratios of 123I-3H11 in tumor-bearing mice

    注(Note):n=5

    圖3 2 h(a)和24 h(b)時(shí)123I-3H11在荷瘤裸鼠體內(nèi)的SPECT顯像圖Fig.3 SPECT imaging of 123I-3H11 in tumor-bearing mice at 2 h(a) and 24 h(b) post intravenous injection

    3 結(jié) 論

    123I標(biāo)記的胃癌單克隆抗體3H11具有很好的生物活性,與BGC823靶細(xì)胞有較高親和力;標(biāo)記物有較好的裸鼠體內(nèi)生物學(xué)行為,靶組織攝取較高,其它組織器官的非特異攝取較低;123I-3H11注射后24 h獲得清晰的腫瘤顯像。123I-3H11放射免疫顯像圖像清晰,是一種非常有潛力的放射性顯像藥物,引入臨床將有待于進(jìn)一步研究。

    [1] 董志偉,魏淑敏,張梅穎,等.胃癌單克隆抗體3H11的應(yīng)用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,1995,2(2):84-87.

    [2] Bruskin A, Sivaev I, Persson M, et al. Radiobromi-nation of Monoclonal Antibody Using Potassium [76Br] (4 Isothiocyanatobenzyl-Ammonio)-Bromo-Decahydro-Closo-Dodecaborate (Bromo-DABI)[J]. Nucl Med Biol, 2004, 31: 205-211.

    [3] 梁亞云,王耐勤,李 農(nóng),等.單克隆抗體與絲裂霉素交聯(lián)物對(duì)人胃癌細(xì)胞的選擇性殺傷作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1989,24(11):801-806.

    [4] 壽成超,李彩鳳,孟 麟,等.抗胃癌單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志,1997,77:434-438.

    [5] Xu G W, Zhang M Y, Liu B G, et al. Radioimmunoguided Surgery in Gastric Cancer Using131I Labeled Monoclonal Antibody 3H11[J]. Semin Surg Oncol, 1994, 10: 88.

    [6] 魏淑敏,郭 琪,劉曉蘭,等.胃癌單克隆抗體的免疫電鏡定位研究[J].中華腫瘤雜志,1991,13(2):87.

    [7] 李振甫,萬(wàn)文徽,張 宏,等.抗胃癌單克隆抗體3H11對(duì)應(yīng)抗原的純化及鑒定[J].生物化學(xué)雜志,1993,9(3):260.

    [8] Chen Donghai, Shou Chengchao. Molecular Cloning of a Tumor-Associated Antigen Recognized by Mono-clonal Antibody 3H11[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 280: 99-103.

    [9] 呂大鵬,徐光煒,張梅穎,等.131I-3H11腹腔給藥對(duì)Wistar大鼠腸道吻合口愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用腫瘤雜志,2003,18:299-301.

    [10] 呂大鵬,徐光煒,張梅穎,等.131I-3H11防治胃癌肝轉(zhuǎn)移瘤形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].腫瘤防治研究,2002,29:291-300.

    [11] 王 川,王 怡,蘇向前,等.125I標(biāo)記單克隆抗體3H11在胃癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)中的應(yīng)用的初步研究[J].外科理論與實(shí)踐,2000,5:163-166.

    [12] 張梅穎,朱家瑞,許小寶,等.131I標(biāo)記胃癌單克隆抗體3G9及F(ab/)2片段和3H11在荷人胃癌移植瘤裸鼠體內(nèi)分布的研究[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志,1989,9:154-157.

    [13] 秦紅斌,尹 衛(wèi),高惠波,等.3H11的123I標(biāo)記及其生物分布[J].同位素,2010,23(2):76-80.

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