堿法提取黃精多糖及提取工藝流程的優(yōu)化*1

趙瑞萌 孫庭閣 張 玲

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

泰山黃精(PolygonatumsibiricumRed)屬百合科多年生草本植物，藥用部分為根莖。因其獨(dú)特的生長環(huán)境和氣候條件在全國多種黃精中被譽(yù)為上品[1]。本實(shí)驗(yàn)所用的泰山黃精為樓臺黃精，又名重樓黃精或雞頭黃精，為泰山正品[2]。黃精性味甘平，具有潤肺滋陰、補(bǔ)中益氣、益腎填精、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力、降血糖、降血脂及抗菌抗病毒等功效[3]。黃精在臨床上主要用于治療糖尿病、冠心病、高脂血癥、白細(xì)胞減少和艾滋病等。研究表明泰山黃精主要含多糖、低聚糖、黃精皂苷、氨基酸、黃酮及微量元素等，其中黃精多糖是黃精的重要組成部分[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明, 黃精多糖對老齡大鼠淋巴細(xì)胞百分率、紅細(xì)胞、晶體核、晶體皮質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)活性、肝臟和腎臟脂褐質(zhì)含量、心臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量, 腦中B 型單胺氧化酶活性均有明顯改善作用[5]。系統(tǒng)研究影響黃精多糖得率的因素，闡明其生物學(xué)活性，對開發(fā)高技術(shù)含量的黃精多糖保健品具有重要意義[6]。本實(shí)驗(yàn)以多糖得率為檢測指標(biāo)，以低濃度的氫氧化鈉作為提取介質(zhì)，探討了不同堿液濃度、不同粒度及固液比對黃精多糖提取的影響，旨在為泰山黃精的質(zhì)量評價(jià)和黃精多糖的開發(fā)利用及工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

AB 265-S 61G/220電子分析天平(瑞士，梅特勒-托利多)； DJ-500A電子天平( 亞太公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國BMH)；UV=755B紫外-可見分光光度計(jì)(江蘇省宜興市儀器儀表總廠)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；BCD-215KC冰箱(青島海爾股份有限公司)；CHN-86801奧立龍酸度計(jì)。

1.2 材料與試劑

黃精采自泰山，經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院中藥教研室鑒定為泰山正品雞頭黃精。苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、蒸餾水、氯仿、正丁醇、氫氧化鈉等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 試劑的配制

2.1.1 NaOH溶液的配制 用電子分析天平精密稱取1.00 g、2.00 g、3.00 g、10.00 g固體氫氧化鈉，用蒸餾水充分溶解后，置容量瓶中定容至100 ml,即得1%、2%、3%、10%NaOH溶液。

2.1.2 Sevag試劑的配制 氯仿與正丁醇按1︰4比例混合即得(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

2.1.3 苯酚溶液的配制 取適量苯酚(餾分好的),取此餾分15.00 g,用蒸餾水充分溶解后，置250 ml容量瓶中, 定容至刻度，搖勻，置于棕色瓶中,冷藏備用。

2.1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 稱取105℃干燥至恒重(前后兩次質(zhì)量差小于2 mg)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1002 g, 置于100 ml容量瓶中, 加蒸餾水溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 取10 ml稀釋到50 ml作為標(biāo)準(zhǔn)使用液備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取上述配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml,分別置于10 ml具塞試管中，依次加蒸餾水使其總體積均達(dá)到2 ml, 然后依次加入6% 苯酚溶液1.0 ml，充分混勻, 迅速加入5.0 ml濃硫酸(加濃硫酸時(shí), 勿沿壁加入, 應(yīng)將移液管口懸于試管口, 使?jié)饬蛩岽怪比胍好?,混勻，放置5 min，沸水浴加熱15 min，取出后冷卻至室溫。另以2.0 ml蒸餾水作為空白對照，所有操作均與上述相同，490 nm 下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo), 葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A =0.0136C, R2=0.9842。

2.3 稀堿法提取黃精多糖的工藝流程

鮮黃精根塊洗凈烘干至恒重后粉碎，分別過20、60、100目篩,加入適量不同濃度堿液過夜后,過濾，離心，濾渣加堿液過夜。然后過濾，離心，合并上清液調(diào)pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，Sevag除蛋白，活性炭脫色，濃縮，乙醇沉淀，洗滌沉淀，真空干燥黃精多糖。

2.4 換算因子的測定

準(zhǔn)確稱取已干燥至恒重的自制黃精多糖0.100 g,置于50 ml干凈燒杯中，用少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，最后用蒸餾水定容，再準(zhǔn)確吸取該溶液1 ml于10 ml容量瓶中，定容，混勻用作儲備液。精密移取該溶液2.0 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度，計(jì)算多糖中葡萄糖的濃度，按下公式計(jì)算換算因子：F=W/(C·D)。W為多糖質(zhì)量(mg)，C為多糖中葡萄糖的濃度(mg/mL)，D為多糖溶液的稀釋倍數(shù)。

2.5 多糖含量的測定

精密吸取黃精多糖樣品溶液1 ml，按照測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的方法測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和換算因子，按下公式計(jì)算樣品中多糖的百分含量：多糖含量(%)=C·D·F/W。公式中C為供試液中葡萄糖的濃度 (mg/mL)，D代表供試液中多糖溶液的稀釋倍數(shù)，F(xiàn)為換算因子；W為供試品的質(zhì)量(mg)。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了選取稀堿提取黃精多糖的最佳條件，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取藥材粒度、堿液濃度、固液比3項(xiàng)為考察因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素-水平設(shè)計(jì)見表1。每份樣品5.00 g，按照上述多糖提取的工藝流程提取多糖，并測定多糖含量。

表1 稀堿法提取黃精多糖的正交實(shí)驗(yàn)水平表

2.7 回收率測定

精密稱取黃精干粉3份，每份5.00 g，依次加入10、20、30 mg葡萄糖，按照上述篩選的最佳條件提取多糖，并按照測定標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的方法測定多糖含量，根據(jù)公式計(jì)算加標(biāo)回收率：P=(Xi-X0)/m×100%。公式中P為加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率，m為加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量，Xi為加標(biāo)樣品的測定值，X0為未知樣品的測定值。計(jì)算得平均回收率99%，RSD為2.15%

2.8 顯色穩(wěn)定性測定

取黃精多糖供試溶液, 依上述實(shí)驗(yàn)方法顯色后, 在30、60、90、120 min測定其吸光度，結(jié)果表明，在120 min內(nèi)測定，多糖溶液顯色穩(wěn)定，吸光度變化不大。

2.9 稀堿提取乙醇沉淀正交實(shí)驗(yàn)法提取黃精多糖的測定結(jié)果

提取條件對多糖得率的影響順序?yàn)锳BC，最佳提取組合是A2B3C1。見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

從表2的直觀分析可以看出，極值R反應(yīng)了3個(gè)因素對多糖提取含量的影響RA>RB>RC,即提取條件對多糖收率的影響順序?yàn)椋核幉牧６?堿液濃度>固液比，并得出該正交實(shí)驗(yàn)的最佳組合為A2B3C1，即藥材粒度為60目，堿液為3%NaOH溶液，固液比為1︰15。

3 討 論

有些多糖在堿液中有更高的提取率，本實(shí)驗(yàn)采用稀氫氧化鈉溶液提取黃精多糖，并對獲得的多糖進(jìn)行初步鑒定。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究原料粒度、堿液濃度和固液比對黃精多糖提取率的影響,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),研究不同因素水平組合條件對多糖得率的影響。結(jié)果表明，藥材粒度是影響黃精多糖提取率的主要因素，三個(gè)因素對黃精多糖提取率的影響順序?yàn)樗幉牧６?堿液濃度>固液比,最佳的提取工藝條件為: 藥材粒度為60目，堿液為3%NaOH溶液，固液比為1︰15。在此條件下黃精多糖的提取率為11.89%。

由于稀堿溶液在浸提多糖的同時(shí)，其它一些可溶性雜質(zhì)也隨之浸出，為了提高稀堿提取的黃精多糖的純度，本實(shí)驗(yàn)利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，用高濃度乙醇沉淀提純多糖，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程簡便省時(shí)，提取率高，且無需加熱，可避免高溫致多糖的分解，易于得到純度高的多糖樣品，是值得探索、推廣的一種多糖提取分離方法。由于稀堿易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂, 使部分多糖發(fā)生水解，故稀堿液浸提結(jié)束后要迅速將提取液pH調(diào)至中性，以免多糖發(fā)生水解。

[1] 李元富，張義濤，劉道富. 泰山藥用植物[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,1996：245.

[2] 畢研文，宮俊華，楊永恒.泰山黃精藥用價(jià)值和栽培技術(shù)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，12(8)86-87.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典2000年版(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2000:252.

[4] 楊文遠(yuǎn)，郭偉，王天勇.寧夏黃精中黃精多糖的分離提取和測定[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18 (2)：359-360.

[5] 王曙東，吳晴齋，李漢保.黃精根莖、須根中營養(yǎng)成分的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)研究，1995，6 (4)：15-16.

[6] 周繇.長白山區(qū)黃精屬植物的種質(zhì)資源開發(fā)利用[J].中國野生植物資源，2002，21(2)：34-35.